Strukturelle Grundlage für die Breitenentwicklung im HIV-Bereich

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2782 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Reifung der Antikörperaffinität ermöglicht adaptive Immunantworten auf eine Vielzahl von Krankheitserregern. Bei einigen Individuen entwickeln sich breit neutralisierende Antikörper, um schnell mutierende Krankheitserreger mit großer Sequenzvielfalt zu erkennen. Bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen Krankheitserreger wie HIV-1 und Influenza lag der Schwerpunkt daher auf der Nachbildung des natürlichen Affinitätsreifungsprozesses. Hier bestimmen wir Strukturen von Antikörpern im Komplex mit der HIV-1-Hülle für alle beobachteten Mitglieder und Vorfahrenzustände der weitgehend neutralisierenden klonalen B-Zelllinie des HIV-1-V3-Glykans, die auf den DH270-Antikörper abzielt. Diese Strukturen verfolgen die Entwicklung der Neutralisationsbreite vom nicht mutierten gemeinsamen Vorfahren und definieren die Affinitätsreifung mit hoher räumlicher Auflösung. Durch die Aufklärung von Kontakten, die durch Schlüsselmutationen in verschiedenen Stadien der Antikörperentwicklung vermittelt werden, identifizierten wir Stellen an der Epitop-Paratop-Grenzfläche, die im Mittelpunkt der Affinitätsoptimierung stehen. Somit identifizieren unsere Ergebnisse Engpässe auf dem Weg zur natürlichen Affinitätsreifung und zeigen Lösungen für diese auf, die das Immunogendesign beeinflussen, das darauf abzielt, durch Impfung eine weitgehend neutralisierende Immunantwort hervorzurufen.

Die Antikörper-Affinitätsreifung aus keimbahnkodierten Immunglobulin-Genen (Ig) der schweren und leichten Kette umfasst iterative Runden somatischer Hypermutation und Selektion, gefolgt von B-Zell-Expansion und -Differenzierung, was letztendlich zur Pathogenneutralisierung führt1. Das Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierung der nächsten Generation und Methoden zur Verfolgung der Antikörperentwicklung hat eine genaue Überwachung des Affinitätsreifungsprozesses ermöglicht2,3. Umfangreiche strukturbasierte Studien von Antikörpern allein oder von Antikörpern in Kontakt mit verwandten Antigenen haben gezeigt, dass Affinitätsgewinne den Erwerb von Mutationen beinhalten, die Antikörper-Antigen-Kontakte, Formkomplementarität, Paratopsteifheit und Antikörperkonformation verbessern2,4,5,6,7, 8. Die Reifung beinhaltet auch eine affinitätsunabhängige Diversifizierung, die zusammen zu einer breiten Palette möglicher Lösungen für das Affinitätsoptimierungsproblem führt4,9. Antikörper mit Neutralisationsbreite können trotz Sequenzvariabilität effektiv an das Zielantigen binden und sind ein wichtiges Ziel für die Entwicklung von Impfstoffen gegen Krankheitserreger wie HIV-1, Influenza und SARS-CoV-2 sowie andere menschliche Coronaviren10,11,12.

Während Influenza- und SARS-Infektionen in der Regel innerhalb relativ kurzer Zeit nach der Infektion ausgeheilt werden, handelt es sich bei HIV-1 um eine chronische, genomintegrierende Infektion, und die Reifung der Antikörper, die zu weitgehend neutralisierenden Antikörpern (bnAbs) führt, erfolgt nur über mehrere Jahre. Ein vorrangiges Ziel der aktuellen HIV-1-Impfstoffbemühungen ist die Definition von Antikörper-Reifungswegen, um das Immunogendesign strategisch zu beeinflussen und eine Beschleunigung dieses Prozesses durch Impfung zu ermöglichen13. Breit neutralisierende Antikörper wurden von Menschen mit HIV (PLWH) isoliert und bilden die Grundlage für viele Impfstrategien, die darauf abzielen, bnAbs zu induzieren14. Die Entwicklung von HIV-1-gerichteten bnAbs erfordert typischerweise das Auftreten eines definierten Satzes spezifisch positionierter Mutationen in Ig-Paaren der schweren/leichten Kette im Antikörperklon, was eine gewaltige Herausforderung beim Immunogendesign darstellt, das auf die Rekapitulation der bnAb-Entwicklung abzielt. Dies wird durch ungewöhnliche HIV-1-bnAb-Merkmale verschärft, darunter ausgedehnte somatische Mutationen, lange schwere Ketten, die die dritte Komplementarität bestimmen (HCDR3s), Ig-Insertionen und -Deletionen, eingeschränkte Keimbahn-Gennutzung und Anreicherung für Mutationen mit geringer Wahrscheinlichkeit15,16,17. Ein detailliertes Verständnis der Affinitätsreifungsschritte, die zur bnAb-Entwicklung führen, einschließlich der Unterscheidung zwischen erworbenen Mutationen, die zur gewünschten bnAb-Reaktion führen, und solchen, die in weniger produktiven Off-Target-Reaktionen gipfeln, ist daher wichtig, um die Determinanten der affinitätsgereiften bnAb-B-Zellen zu identifizieren Auswahl des Rezeptors (BCR).

Die Untersuchung der Koevolution von Virus- und Antikörperklonen während einer HIV-Infektion beeinflusst das Impfstoffdesign durch die Definition der HIV-1-Hüllenvarianten (Env), die sich während der bnAb-Entwicklung entwickeln, und liefert so eine Blaupause für das iterative Immunogendesign7,18,19,20. Die Ziele für HIV-1-bnAbs sind konservierte Epitope auf dem Env-Protein21,22,23,24. Das HIV-1-Env ist ein Trimer aus gp120-gp41-Heterodimeren, die durch N-verknüpfte Glykosylierung stark vor dem Immunsystem des Wirts geschützt und durch Konformationsmaskierung und erhebliche Sequenzvariabilität zusätzlich vor Neutralisierung geschützt sind.

Eine glykosylierte Region nahe der Basis der dritten variablen Schleife (V3) von HIV-1-Env bildet eine Superstelle der Anfälligkeit, auf die Antikörper abzielen, die aus verschiedenen Keimbahngenen bei mehreren HIV-1-infizierten Personen stammen25. Die Entwicklung eines weitgehend neutralisierenden V3-Glykan-Antikörpers wurde an einem afrikanischen, mit AIDS lebenden Mann aus Malawi (CH848, Klade C) untersucht, der vom Zeitpunkt der Infektion bis zu 5 Jahre nach der Übertragung beobachtet wurde20. Beim CH848-Individuum führte das frühe Auftreten zweier autologer „kooperierender“ neutralisierender B-Zell-Klone (DH272 und DH475) zur Selektion viraler Escape-Varianten, die wiederum den DH270-Klon stimulierten, der sich weiterentwickelte, um eine wirksame Neutralisierungsbreite zu erreichen20. Die DH270-Linie leitet sich von den Genen der schweren bzw. leichten Kette VH1-2*02 und Vλ2-23 ab, mit einer komplementären bestimmenden Regionslänge der schweren Kette von zwanzig Aminosäureresten20, DH270.6, dem Linienmitglied mit der größten Breite und Potenz neutralisiert einundfünfzig Prozent eines Multicladen-Pseudovirus-Panels mit einer geometrischen mittleren Potenz von ~0,21 µg/ml26. Mit somatischen Mutationsraten von 12,8 bzw. 6,7 Prozent für die Gene der schweren und leichten Kette gehört DH270.6 zu den am wenigsten mutierten V3-Glykan-bnAbs26. DH270-Antikörper wurden in der CH848-Person in Woche 186 nachgewiesen und fielen mit dem Auftreten von Env-Varianten mit einer verkürzten variablen Schleife 1 (V1)20 zusammen. Der abgeleitete DH270-unmutierte gemeinsame Vorfahren-Antikörper (DH270.UCA), der den naiven B-Zell-Vorläufer des DH270-Klons darstellt, neutralisiert heterologes HIV-1 nicht, obwohl eine einzelne Aminosäureänderung an Position 57 der schweren Kette erfolgt, die ein Glycin ersetzt ein Arginin (G57R) führte zu einer heterologen HIV-1-Neutralisierung, wenn auch mit begrenzter Breite. Als die Affinität des DH270-Klons reifte und die Antikörper Mutationen in ihren variablen Regionen der schweren und leichten Kette (VH und VL) anhäuften, verbesserten sich Breite und Wirksamkeit der heterologen Neutralisierung. Die frühen intermediären Antikörper der Vorfahren DH270 waren in der Lage, heterologe Viren mit kurzen V1-Schleifen zu neutralisieren. Die klonale Abstammungslinie der DH270-B-Zellen hat sich weiterentwickelt, um die Fähigkeit zu erlangen, Viren mit längeren V1-Schleifen zu neutralisieren, allerdings mit verringerter Wirksamkeit20. Eine ähnliche umgekehrte Korrelation zwischen Wirksamkeit und V1-Länge wurde für andere V3-Glykan-bnAbs 10-1074, PGT121 und PGT12827,28 beobachtet. Der umfangreiche Datensatz von koevolvierenden Antikörpern und Envs, der für den DH270-Klon20 verfügbar ist, bot die Möglichkeit, strukturelle Aspekte der Affinitätsreifung und Virus-Koevolution mit einem noch nie dagewesenen Detaillierungsgrad zu untersuchen und zu definieren, wie diese Informationen das Impfstoffdesign beeinflussen werden, das darauf abzielt, bnAbs hervorzurufen, die auf das DH270-Klon abzielen V3-Glykan-Supersit.

Drei wichtige Entdeckungen haben unser aktuelles Verständnis des DH270-Klons geprägt. Obwohl somatische Hypermutation ein stochastischer Prozess ist, gibt es in der Antikörpersequenz für durch Aktivierung induzierte Cytidin-Desaminase (AID) vermittelte somatische Mutationen Hot Spots und Cold Spots, was zu Unterschieden in der Wahrscheinlichkeit führt, mit der Antikörperreste mutiert werden. In Kombination mit der möglichen Notwendigkeit mehrerer Basenwechsel kann dies dazu führen, dass bestimmte Mutationen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit auftreten, die hier mit weniger als zwei Prozent definiert ist. HIV-1-bnAbs, einschließlich derjenigen im DH270-Klon, sind mit wichtigen Mutationen mit geringer Wahrscheinlichkeit angereichert17. Zweitens sind von den zweiundvierzig Mutationen im breitesten und wirksamsten Mitglied dieses Klons nur zwölf erforderlich, um neunzig Prozent seiner Breite zu erreichen, was es uns ermöglicht, die kritischsten Regionen des Antikörpers zu lokalisieren, die optimiert werden müssen29. Schließlich haben wir gezeigt, dass rational gestaltete Immunogene DH270-bnAb-V3-Glykan-Vorläufer erweitern können, was für die Betrachtung der Affinitätsreifung im Zusammenhang mit der Impfstoffentwicklung von entscheidender Bedeutung ist21.

Hier verwendeten wir Kryo-EM, um die Wechselwirkungen eines vollständigen abgeleiteten DH270-Klonbaums mit dem sich gemeinsam entwickelnden Virus Env zu visualisieren. Wir definieren die Abwehrmechanismen, die das Virus zur Abschirmung seines V3-Glykan-Epitops während der Infektion aufbaut, und zeigen, wie sich der DH270-Klon entwickelte, um zunächst Env anzugreifen, und dann reifte, um diese Barrieren wirksam zu umgehen und eine Neutralisierungsbreite zu erreichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Klonentwicklung sequenzielle Lösungen zur Affinitätssteigerung an spezifischen Antikörper-Antigen-Kontaktstellen beinhaltete. In jedem Entwicklungsstadium folgte auf den Erwerb einer Lösung die Aufspaltung des Klons in verschiedene Unterklone, was zu unterschiedlichen Zuwächsen in der Affinität und Neutralisierungsbreite führte. Diese Ergebnisse zeigten, dass früh im Klon erworbene Mutationen das Schicksal der nachgeschalteten klonalen Affinitätsreifung von DH270 bestimmten. Die Antikörperreifung umfasste eine schrittweise, ortsspezifische Optimierung der Epitop-Paratop-Kontakte, wobei sich der Schwerpunkt verschob, da sich ausweichende Mutationen auf der Antigenoberfläche anhäuften.

Die Strukturen mehrerer DH270-Antigen-bindender Fragmente (Fabs) wurden zuvor bestimmt, einschließlich abgeleiteter DH270-UCAs sowie der reifen DH270.3-, DH270.5- und DH270.6-Antikörper, die aus dem CH848-Individuum isoliert wurden. Darüber hinaus wurden Strukturen eines DH270.1-Einzelkettenvariablenfragments (scFv), eines Mannose-assoziierten DH270.3, eines V3-Glykanpeptid-assoziierten DH270.6 scFv und von löslicher Env-Ektodomäne gebundenem DH270 UCA und DH270.6 Fabs20 bestimmt ,21,30. Während die V3-Glykan-assoziierte DH270.6-Struktur die Rolle einzelner Reste klärte, die für die Neutralisierungsbreite entscheidend sind, enthüllte sie weder den strukturellen Weg, der der Entwicklung dieser Breite zugrunde liegt, noch zeigte sie, wie Breite und Wirksamkeit durch Mutationen in verschiedenen DH270-Kladen beeinflusst wurden Unterklassen. Wir versuchten daher, die Auswirkung von Mutationen in jedem Reifungsstadium zu bestimmen, indem wir Kryo-EM-Strukturen von HIV-1-Env-assoziierten klonalen DH270-Mitglieds-Fabs aus jedem Antikörper-Vorläuferzwischenprodukt und allen reifen Antikörperformen bestimmten (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). und 2). Ein lösliches SOSIP-Trimer, das von einem Virus stammt, das am Tag 949 nach der Übertragung aus dem CH848-Individuum isoliert wurde (hier als d949-Env bezeichnet), wurde zur Herstellung von Komplexen mit DH270-Klon-Fabs für Strukturstudien verwendet. Dieser Umschlag wurde aufgrund seiner zeitlichen Nähe zum Auftreten der DH270-Linie beim infizierten Patienten und weil er mit allen Mitgliedern der DH270-Linie interagiert, ausgewählt. Mit der Env-Konstante können alle beobachteten Strukturunterschiede auf Unterschiede in den Antikörper-Aminosäuren zurückgeführt werden. Die Kartenauflösungen lagen zwischen 5,3 und 3,3 Å, wobei die lokalen Auflösungen an der Fab-Env-Grenzfläche im Bereich von 5–3 Å lagen (Ergänzende Abbildungen 2–4, Tabellen 1 und 2).

A (oben links) Eine DH270-Antikörper-Fab-gebundene HIV-1-Hülle (Env)-Ektodomäne, wobei die Untereinheiten gp120 (blau) und gp41 (orange) hervorgehoben sind. Die schweren und leichten Ketten der Antikörper-Fab sind rot bzw. grau gefärbt, wobei die Epitop-Glykane in Stabdarstellung dargestellt sind. (rechts) Vergrößerte Draufsicht und Seitenansicht der Paratop-Epitop-Kontakte. Gestrichelte Kreise zeigen unterschiedliche Kontaktbereiche an. (unten links) Nummernindikatoren identifizieren Kontaktstellen, die durch die gestrichelten Kreise in den Feldern rechts hervorgehoben sind. B Der abgeleitete phylogenetische Baum des DH270-Klons mit Kryo-EM-Karten, die für jedes klonale Mitglied Fab ermittelt wurden, das an das CH848-d949-Trimer gebunden ist (weiß). Die Namen der klonalen Mitglieder werden entsprechend der Fab-Farbe jeder Karte eingefärbt. Die schwarze Nummerierung zeigt die Orte der Folgemutationen in jedem Antikörper gemäß den in A aufgeführten Stellen an. Affinitäten für Antikörper auf dem Weg, der zur breitesten und wirksamsten reifen Form, M6, führt, sind in Rosa angegeben. Zwischenklonale Mitglieder werden mit einem I gekennzeichnet, während reife Antikörper mit einem M gekennzeichnet werden.

Die Kartierung der Mutationen des DH270-Klons auf den Kryo-EM-Strukturen ergab geclusterte Stellen, die nacheinander entlang des B-Zell-Klonbaums mutiert sind (Abb. 1A). Diese Cluster wurden auf sieben verschiedene Stellen des Antikörper-/Env-Kontakts abgebildet: (1) Wechselwirkung des distalen D1-Arms des Env-N332-Glykans mit der Spalte, die zwischen den Fab-variablen Schwer- und Leichtkettensegmenten (VH/VL) gebildet wird, an der die Leicht- Kettenkomplementarität bestimmende Region zwei (LCDR2) und schwere Kettenkomplementarität bestimmende Region drei (HCDR3), (2) Wechselwirkung der N332-Glykan-GlcNac-Base mit der Antikörper-HCDR3-Region, (3) Kontakt der Env V1-Schleife und des konserviertes GDIR/K-Motiv in der V3-Schleife mit den Fab HCDR3- und HCDR2-Regionen, (4) Wechselwirkung der D-Arme des Env N156-Glykans mit der Antikörper-Gerüstregion, (5) Wechselwirkung der Env N301-Glykan-Base GlcNac- 1 und Reste um das V3-GDIR/K-Motiv mit der Fab-LCDR3-Region, (6) Kontakt des Env-N301-Glycan-Verzweigungspunkts und der D-Arme mit der Fab-LCDR1/VL-N-Terminus-Stelle und (7) Kontakt des Env N442-Glykan mit Fab LCDR1-Region (Abb. 1A). Zusammen umfassen diese die gesamte interaktive Oberfläche, die den DH270-Klon-Antikörpern zur Verfügung steht.

Die Kryo-EM-Rekonstruktionen wurden an den Ab/Env-Grenzflächen aufgelöst, um die Erstellung atomarer Modelle zu ermöglichen. Wir haben keine klaren Verbesserungsmuster bei den Schnittstellenauflösungen bei erhöhter Interaktionsstärke beobachtet. Dies könnte auf die Variabilität in den Kryo-EM-Datensätzen sowie auf eine Verringerung der thermischen Stabilität in der DH270-Linie während der Affinitätsreifung zurückzuführen sein6.

Entlang des DH270-Klonbaums traten an den oben beschriebenen interaktiven Env-Stellen klare Mutationsmuster auf, die darauf hindeuteten, dass sich der DH270-Klon weiterentwickelte, um spezifische, sequentielle strukturelle Engpässe auf dem Weg der Affinitätsreifung zu beheben (Abb. 1B). Das erste Zwischenprodukt, I5, erwarb Mutationen, die die Wechselwirkungen an den Clustern 3 und 6 verstärkten, indem sie die Protein-Protein-Kontakte sowie die Wechselwirkungen des Antikörpers mit dem N301-Glykan verbesserten, was zu einer etwa achtfach verbesserten Bindungsaffinität zum d949-Env im Vergleich zu führte die UCA. Nach dem Intermediat I5 teilt sich der Klon in zwei unterschiedliche Pfade entlang einer Gruppe, die durch das I3-Intermediat definiert wird, und einer Gruppe, die durch das I4-Intermediat definiert wird. Diese daraus resultierende Spaltung führt zum Erwerb einer größeren Neutralisierungsbreite und -wirksamkeit in der I3-Klade, was zum DH270.6-bnAb führt (Abb. 1B)20. Beide Kladen erwarben Mutationen rund um die N332-Glykan-Interaktionsstelle, jedoch an unterschiedlichen Positionen. Das I3-Intermediat verbessert die Interaktion mit dem distalen N332-Glycan-D1-Arm (Cluster 1), während das I4-Intermediat die Interaktion mit der N332-Glycan-GlcNac-Base (Cluster 2) verbessert. Jedes Zwischenprodukt spaltet sich dann in zwei Unterklassen auf und legt ein konserviertes Env-Ziel für die Kontaktoptimierung durch drei der vier reifen/intermediären Antikörper frei. Dazu gehören der reife I4-Kladen-Antikörper DH270.3, der I3-Kladen-reife Antikörper DH270.1 und der intermediäre Antikörper I2, die alle mehrere Mutationen aufweisen, die in oder neben der Antikörper-LCDR3-Region geclustert sind und vermutlich die Wechselwirkungen mit der Env N301-Glykanbase verbessern ( Cluster 5). Der reife I4-Clade-Antikörper DH270.2 erwarb Mutationen, die sich auf Cluster 1 konzentrierten, und verbesserte die Wechselwirkungen am N332-Glykan-D1-Arm auf ähnliche Weise wie beim I3-Intermediat. Das I2-Intermediat erwarb zusätzliche Mutationen in den Clustern 3, 4 und 7, wobei der reife DH270.6, der breiteste und wirksamste Antikörper des Klons, die Wechselwirkungen in Cluster 7 weiter modifizierte. Ein minimal mutierter DH270-Antikörper (minDH270) wurde nur dort entwickelt29 12 der 42 Mutationen in DH270.6 waren erforderlich, um ~90 % der Breite und Wirksamkeit von DH270.6 zu erreichen. Wichtig ist, dass die Mutationen nur diejenigen umfassten, die in I5, I3 und I2 auftraten. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung traten Mutationen nach I2 an weiter entfernten Stellen auf und ihre Auswirkungen waren weniger deutlich im Vergleich zu den Mutationen, die in den vorherigen Mitgliedern des DH270-Klons auftraten, wie unten beschrieben. Die Antikörper DH270.5 und DH270.6 haben mehrere Mutationen in der Nähe des LCDR1/VL-N-Terminus erworben, wo es zu Wechselwirkungen mit den N301-Glykan-D-Armen kommen kann. Die Kryo-EM-Rekonstruktionen in dieser Region waren schlecht aufgelöst, was eine genaue Definition dieser Wechselwirkungen unmöglich machte. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Reifung des DH270-Klons einen sequentiellen Affinitätsgewinn an verschiedenen Stellen mit sich brachte und dass spezifische strukturelle Lösungen für den Affinitätsgewinn und die Entwicklung der Neutralisationsbreite erforderlich waren. Dies wird durch die Dichotomie veranschaulicht, bei der der Erwerb von Mutationen in der LCDR3-Region des Antikörpers zu einer Zunahme der Neutralisationsbreite in DH270.1 und im I2-Intermediat, aber zu einem Verlust der Neutralisationsbreite in DH270.3 führte.

Als nächstes untersuchten wir die spezifischen strukturellen Anordnungen, die der Reifung in jedem Stadium zugrunde liegen, und untersuchten zunächst Mutationen im I5-Intermediat (Abb. 2A, B). Wir haben zuvor Strukturen für die DH270-UCA und die reifen DH270.6-Fabs bestimmt, die an das CH848-d949-Env-Trimer gebunden sind, wobei die V1-Schleifenglycane an den Positionen 133 und 138 entfernt wurden21. In der UCA-gebundenen Struktur interagiert die V1-Schleife mit dem Antikörper, dem V3-GDIK-Motiv und angrenzenden V3-Resten, während im DH270.6-gebundenen Env die V1-Schleife von dieser Position verschoben wurde, sodass sie nicht mehr mit dem V3-GDIK interagiert Motiv. Diese Verschiebung wurde auf die VH-G57R-Mutation zurückgeführt, die im ersten Zwischenprodukt auftritt21. Um die V1-Schleifenkonformation sichtbar zu machen, wenn sie nicht an einen Antikörper am V3-Glykan-bNAb-Epitop gebunden ist, haben wir die Struktur des d949-SOSIP-Env im Komplex mit dem CD4-Bindungsstellen-Antikörper VRC01 bestimmt. Wir fanden heraus, dass die Konformation der ungebundenen V1-Schleife der der UCA-gebundenen V1-Schleife ähnelte (ergänzende Abbildung 6A). Wir haben außerdem die Struktur von DH270.UCA bestimmt, die die VH G57R-Mutation im Komplex mit dem CH848 d949 SOSIP Env enthält (Abb. 2C und ergänzende Abb. 6B). Die V1-Schleife in der UCA + G57R-Struktur wurde von ihrer Position verschoben, die in ihren freien und UCA-gebundenen Formen beobachtet wurde, wo sie mit dem V3-GDIK-Motiv interagierte und es abschirmte (ergänzende Abbildung 6C). Die Verschiebung der V1-Schleife in der UCA+G57R-Struktur geht mit einer deutlichen Verschiebung der Antikörperorientierung einher, wodurch das Fab-VH/VL in Richtung des Raums gedreht wird, der zuvor von der V1-Schleife eingenommen wurde, wodurch der Antikörper näher an das Env herangezogen wird (Abb. 2C). und ergänzende Abb. 6D). Der Vergleich der Struktur des UCA+G57R-gebundenen Komplexes mit dem I5-gebundenen Komplex ergab weitere Verschiebungen in der Orientierung des Antikörpers, die durch die anderen erworbenen Mutationen im I5-Intermediat orchestriert wurden. Die VL-S27Y-Substitution in der Nähe des β-Mannose-Verzweigungspunkts des N301-Glykans ist wahrscheinlich der Schuldige und verändert die Ausrichtung des N301-Glykans im I5-gebundenen Komplex relativ zum UCA+G57R-gebundenen Komplex (Abb. 2D).

Ein DH270-Klonbaum, der die intermediären Antikörper UCA und I5 hervorhebt. B Draufsicht und Seitenansicht der I5-Kontaktstelle. Alpha-Kohlenstoffe (Cα) der Mutation der schweren und leichten Kette werden als Kugeln dargestellt. C Draufsicht auf die Kontakte der schweren Kette von UCA und UCA+G57R mit gp120, wobei die Verschiebungen in der Antikörperposition und in der Env gp120 V1-Schleife hervorgehoben werden. Die gestrichelte Cartoon-Darstellung für das UCA-G57R-gebundene Env V1 verbindet die Reste 133 und 153, zwischen denen die Kartendichte für V1 schwach ist. D Gauß-gefilterte Karte des UCA+G57R-Fab-gebundenen Trimerkomplexes (grau), überlagert mit einer gefilterten und subtrahierten Karte des I5-Fab-gebundenen Trimerkomplexes (grün). Der Ort der S27Y-Mutation ist auf den Karten orange markiert. E (oben links) Kontaktwinkel Theta und Dieder Phi mit den Positionen der für die Berechnungen verwendeten Schwerpunkte, angegeben durch Kugeln. (Mitte links) Ausrichtung (nur gp120) der an UCA und UCA+G57R gebundenen Zustandsstrukturen, was die Verschiebung der Antikörperdisposition um den Theta-Winkel hervorhebt. (unten links) Ausrichtung (nur gp120) der UCA+G57R- und I5-gebundenen Zustandsstrukturen, die die Verschiebung der Antikörperdisposition um das Phi-Dieder hervorheben. (oben rechts) Antikörper-Fab-VH/VL-Schwerpunktabstand vom gp120-Epitopschwerpunkt. (unten rechts) Theta-gegen-Phi-Diagramm für die UCA-, UCA+G57R- und I5-Strukturen. Die Farben der Datenpunkte stimmen mit den jeweiligen Farben der schweren Ketten in den Strukturen überein.

Als nächstes haben wir diese Verschiebungen in der Antikörperorientierung mithilfe vektorbasierter Winkel zwischen dem Antikörper-Fv und seinem gp120-Epitop quantifiziert. Schwerpunkte für das Epitop, das Fv und ein Ankerpunkt im VH wurden verwendet, um den Abstand zwischen dem Fv und seinem Epitop und den Winkel (Theta) zu bestimmen, wobei ein zusätzlicher Ankerpunkt im Epitop hinzugefügt wurde, um die Drehung (Phi) des zu untersuchen Antikörper relativ zum Epitop (Abb. 2E). Theta und Phi beschreiben den Antikörper-Annäherungswinkel in Bezug auf das Epitop und ermöglichen eine genaue Untersuchung von Unterschieden in der Antikörperdisposition, wenn sich Mutationen im Klon ansammeln. Der Abstand zwischen dem Antikörper und dem Epitop wurde in der UCA+G57R-gebundenen Struktur im Vergleich zur UCA-gebundenen Struktur um ~0,5 Å verringert, wobei weitere geringfügige Verringerungen in I5 im Zusammenhang mit den zusätzlichen I5-Mutationen beobachtet wurden (Abb. 2E). Ein Vergleich der Winkel- und Diederanordnungen der UCA- und UCA+G57R-Strukturen zeigte eine Drehung von jeweils ~2°. Das I5-Intermediat zeigte eine weitere Drehung um das Phi-Dieder in Richtung der S27Y-Mutation ohne zusätzliche Änderungen im Theta-Rotationswinkel. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass frühe Mutationen im DH270-Klon verbesserte Kontakte ermöglichen, die Position des Antikörpers relativ zum gebundenen Env verschieben und die Env-Konformation, insbesondere der V1-Schleife und des N301-Glykans, verändern, wobei die Winkel- und Konformationsänderungen weiter verstärkt werden Antikörper-Env-Wechselwirkungen.

Als nächstes untersuchten wir die frühe Entwicklung von zwei unterschiedlichen Kladen im DH270-Klon aus dem I5-Intermediat (Abb. 3A, B). Das I3-Intermediat, das nach I5 im DH270.6-Klon auftritt, umfasst die Mutationen der schweren Kette V11M, R87T und die unwahrscheinliche Mutation R98T sowie die Mutationen der leichten Kette L48Y und S54N. Die Kryo-EM-Rekonstruktion des I3-Fab-gebundenen Env wurde mit einer Auflösung von 4,5 Å bestimmt. Die durch den VH-Rest R57 induzierte Konformationsänderung der V1-Schleife blieb erhalten, ebenso wie die Wechselwirkung des VL-Rests Y27 mit dem N301-Glykan (Abb. 3B und ergänzende Abb. 7A, B). Es wurden keine wesentlichen Unterschiede in den I5- und I3-Fab-gebundenen Env-Struktur-gp120- und gp41-Untereinheiten beobachtet (RMSDs ~ 0,9 Å; ergänzende Abbildung 7C). Wie bereits beschrieben30 führen die VL-L48Y- und VH-R98T-Mutationen neue Wasserstoffbrückenbindungskontakte ein, wobei das Y48-Hydroxyl mit dem N332-Glykan interagiert und die Freisetzung von D115 durch die R98T-Mutation die Anzahl der D115-Wasserstoffbrückenwechselwirkungen mit dem N332-Glykan erhöht (Abb. 3C und ergänzende Abb. 7D). Darüber hinaus führte die I3-VH-R98T-Substitution eine Wasserstoffbindung zwischen den Seitenketten der Reste T98 und VH-Y27 ein (ergänzende Abbildung 7E) und stärkte so die interne Stabilität der Antikörperstruktur, indem sie den Verlust der Kation-π-Wechselwirkung von R98 kompensierte mit Y27. Die Mutationen VH R87T und VL S54N sind von der gp120-interaktiven Region des Antikörpers entfernt. Eine genaue Untersuchung der lokalen Regionen dieser Mutationen deutete darauf hin, dass diese Substitutionen möglicherweise eine Rolle bei der Erhöhung der inneren Stabilität des Antikörpers spielen. Die VH R87T-Substitution verringert die elektrostatische Belastung, die durch drei räumlich gruppierte Arginine, R67, R85 und R87, verursacht wird (Abb. 3D und ergänzende Abb. 7F). Bemerkenswert ist, dass ein zweites Arginin in diesem Cluster, R85, im nächsten Schritt beim Übergang von I3 zu I2 zu Serin mutiert. Darüber hinaus geht die T87-Seitenkette eine Wasserstoffbrücke mit dem Hauptkettenstickstoff des Rests VH D89 ein und erhöht so die Stabilität der lokalen Struktur. Die Wirkung von VL S54N war subtiler, da N54 offenbar die Wechselwirkung mit einem benachbarten Beta-Strang über Wasserstoffbrückenbindungen seiner Seitenkette mit der Hauptkette des Leichtkettenrests 66 zu stabilisieren schien (ergänzende Abbildung 7G).

Ein DH270-Klonbaum, der die intermediären Antikörper I5, I3 und I4 hervorhebt. B Draufsichten auf die Kontaktstellen I3 und I4. Alpha-Kohlenstoffe (Cα) von Mutationen der schweren und leichten Kette werden als Kugeln dargestellt. C (links) Der N332-Glykan-D1-Armkontakt mit der I5-VH/VL-Spalte. (rechts) Der N332-Glykan-D1-Armkontakt mit der I3-VH/VL-Spalte. D Struktur des I3-Intermediats an der R87T-Stelle in der Nähe potenzieller N156-Glykan-Kontakte. E Ausgerichtete I5- und I3-VH-Domänen, die die Änderung des Ellenbogenwinkels hervorheben (Magenta). F (links) Karte und Anpassung der Koordinaten des neuen N332-Glykan-Kontakts, der an der Mutationsstelle I4 HCDR3 S108Y gebildet wurde. (rechts) Ausgerichtete I5- und I4-VH-Domänen mit HCDR3-Schleifenanordnungen.

Die I5- und I4-Antikörperstrukturen waren ähnlich, und wie in früheren Molekulardynamiksimulationen vorhergesagt6, induzierte die V11M-Mutation in I3 eine deutliche Verschiebung im Antikörper-Fab-Ellenbogenscharnier (Abb. 3E). Im Gegensatz zu I3 erhielt das I4-Intermediat keine Ellenbogenmutation und zeigte folglich keine deutliche Verschiebung in der Ellenbogenregion (ergänzende Abbildung 7H). Wie in I3 zeigte der R57-Rest in I4 Hinweise auf eine Verschiebung der Position der V1-Schleife (ergänzende Abbildung 7I). Allerdings wurde in dieser Region eine zusätzliche Dichte beobachtet, die mit einer GDIK-gekoppelten V1-Schleife übereinstimmt, was auf ein Verhalten mit mehreren Zuständen schließen lässt. Das I4-Intermediat erwarb eine größere Anzahl von VH-Mutationen, darunter zwei in HCDR3, Y106V und S108Y, die im Wesentlichen die Position des Tyrosins von Rest 106 nach 108 verschieben. Die Hydroxylgruppe in I4 Y108 bildete eine Wasserstoffbrücke mit dem N332 GlcNac-2 (Abb. 3F links). Die Konformation des HCDR3-Rückgrats wurde durch diese Mutationen nicht verändert (Abb. 3F rechts). Die I4-S84R-Mutation befindet sich in der Nähe der distalen N156-Glycan-Zuckereinheiten. Die Dichten für die Seitenkette und diesen Teil des N156-Glykans waren in der Kryo-EM-Rekonstruktion jedoch nicht sichtbar (ergänzende Abbildung 7J, K). Die verbleibenden Mutationen in der schweren I4-Kette an den Positionen G49A, N54T, Q62R und Y116S spielen keine eindeutig entschlüsselbare Rolle bei der Interaktion mit Env oder bei der Modifikation der Antikörperstruktur. Die leichte Kette enthält zwei Nicht-Paratop-Mutationen, R56W und V100I. Es wurden keine Veränderungen um die V100I-Position relativ zu I5 oder I3 beobachtet. Der Rest R59W der I4-Leichtkette, der an die LCDR2-Region angrenzt, zeigte eine geringfügige Umlagerung, die die Position der distalen N332-Glycan-interaktiven Reste verschiebt (ergänzende Abbildung 7L). Dies war nicht mit offensichtlichen Veränderungen der Antikörperinteraktionen mit dem Glykan verbunden, obwohl es möglicherweise zu einer Stabilisierung der LCDR2-Schleife und damit der Glykaninteraktion führt. Diese Beobachtungen zeigen, dass in diesem Entwicklungsstadium die Interaktionen mit dem N332-Glykan im Mittelpunkt der Optimierung in beiden Kladen des DH270-Klonbaums standen.

Die I4-Klade führt zu den reifen Antikörpern DH270.2 und DH270.3 (Abb. 4A, B). DH270.2 zeigte eine größere Breite und Wirksamkeit als DH270.3, wobei jeweils zehn bzw. fünfzehn Mitglieder aus einem heterologen Panel mit 24 Viren neutralisiert wurden, obwohl beide im Vergleich zu den reifen Antikörpern der I3-Klade, die sechzehn bis siebzehn Mitglieder neutralisieren, eine schwächere Neutralisierungsbreite und -stärke aufwiesen des heterologen Panels21. Die Ausrichtung der Env-gebundenen Strukturen zeigte deutliche Verschiebungen in der Ausrichtung jedes Antikörpers im Vergleich zum I4-Intermediat (Abb. 4C und ergänzende Abb. 8A). Die Untersuchung der Theta- und Phi-Winkel ergab, dass DH270.3 seine Rotation überwiegend um das Epitop verschoben hatte (Abb. 4D). Die bemerkenswerteste Mutation in DH270.3 war die Y27S-Reversion der leichten Kette. Es wurde eine deutliche Verschiebung der Position des N301-Glykans im Vergleich zum I4-Zwischenprodukt beobachtet (Abb. 4E und ergänzende Abb. 8B). In Übereinstimmung mit der beobachteten Drehung des gebundenen Antikörpers im I5/Env-Komplex relativ zum UCA+G57R/Env-Komplex führte die Y27S-Reversion dazu, dass DH270.3 eine Ausrichtung einnahm, die zu UCA+G57R passte (Abb. 4F). Diese Umkehrung der Antikörperorientierung legt nahe, dass die S27Y-Substitution, die erstmals in I5 erworben wurde, der Treiber für die Antikörperrotation und N301-Glykan-Neuorientierung ist, die beim Übergang von UCA zu I5 beobachtet wurde.

Ein DH270-Klonbaum, der die intermediären Antikörper I3 und I2 und den reifen Antikörper DH270.1 (M1) hervorhebt. B Draufsichten auf die Kontaktstellen I2 und DH270.1. Alpha-Kohlenstoffe (Cα) von Mutationen der schweren und leichten Kette werden als Kugeln dargestellt. C Ausrichtung (nur gp120) von I3- und I2-gebundenen Zustandsstrukturen, die die Verschiebung in der gp120-V1-Schleifenanordnung und den Kontakt zwischen der I2-R84-Seitenkette und dem N137-Glykan hervorhebt. D Ausrichtung (nur gp120) von UCA- und I2-gebundenen Strukturen, die die Konformationsähnlichkeit zwischen den gp120-V1-Schleifen hervorhebt. E (rechts) Antikörper-Fab-VH/VL-Schwerpunktabstand vom gp120-Epitopschwerpunkt. (links) Theta-Phi-Diagramm für die I3-, I2- und DH270.1-Strukturen. Die Farben der Datenpunkte stimmen mit den jeweiligen Farben der schweren Ketten in den Strukturen überein. F Seitenansichtsvergleich des Epitopkontakts der LCDR3-Region zwischen I3 und I2, der die Verschiebung der LCDR3-Konformation hervorhebt (magentafarbener Pfeil). G Draufsichtvergleich des Epitopkontakts der LCDR3-Region zwischen I3 und I2, der die Verschiebung im Rotamer des aromatischen Rests 93 hervorhebt (magentafarbener Pfeil). H-Ausrichtung (nur gp120) von I3- und DH270.1-gebundenen Zustandsstrukturen mit DH270.1-Karte, die die Y106S-Mutation hervorhebt.

Eine Gruppe von Mutationen, darunter eine unwahrscheinliche VH-G110Y-Mutation, tritt in und um den DH270.3-LCDR3 auf, nahe dem Kontakt zwischen einer Schleife neben dem V3-GDIK-Motiv und der N301-Glykan-GlcNac-Base. Zusätzliche Mutationen, F93S, A94T, G95N und S97A, führen zu einer Umgestaltung der N301-Glykan-Wechselwirkung und verschieben die Position der LCDR1-Y32-Seitenkette für die Wechselwirkung mit dem ersten N301-GlcNac und die Wechselwirkung von N95 mit dem zweiten N301-GlcNac ( Abb. 4G). Zusätzlich zur Winkelverschiebung und den LCDR3-bedingten Mutationen fügt eine G103S-Mutation in HCDR3 eine Wasserstoffbrücke mit der N332-Glykan-GlcNac-2-N-Acetyl-Einheit hinzu (ergänzende Abbildung 8C). Während DH270.3-Mutationen die Wechselwirkungen mit dem N301-Glykan optimierten, konzentrierten sich die DH270.2-Mutationen stattdessen auf die N332-Glykan-Wechselwirkung im D1-Arm. Von den drei Mutationen der schweren Kette R98K, W101Y und D115N zeigte die D115N-Mutation die deutlichste Verschiebung in der Interaktion. Durch den Verlust der negativen Ladung an D115N konnte sich die Asparaginseitenkette um etwa 1,6 Å vom positiv geladenen K98 entfernen (D und N Cγ zu R Nε oder K Cε), um ein ausgedehntes Wasserstoffbindungsnetzwerk mit dem N332-Glykan-D1-Arm zu bilden (Abb. 4H). Dies spiegelte die R98T-Mutation in I3 wider, bei der D115 von seiner Wechselwirkung mit dem positiv geladenen VH-Rest R98 befreit wurde, um das N332-Glykan zu aktivieren. Insgesamt lässt die Analyse der Env-gebundenen DH270.2- und DH270.3-Strukturen darauf schließen, dass jede unterschiedliche Entwicklungspfade verfolgte und jeweils auf unterschiedliche Standorte abzielte. Die größere Breite des DH270.2-Antikörpers im Vergleich zu DH270.3 ist wahrscheinlich ein kombinierter Effekt der Verbesserung der N332-Glykan-Wechselwirkung bei DH270.2 und der Y27S-Reversion bei DH270.3.

Die nächste Entwicklungsstufe im I3-Klade des DH270-Klons führte zu den deutlichsten Zuwächsen bei der Env-Bindungsaffinität (Abb. 1B) und der HIV-1-Neutralisierungsbreite20. Das I3-Intermediat spaltet sich in das I2-Intermediat und den reifen DH270.1-Antikörper auf, die beide Mutationen erwerben, die sich hauptsächlich auf die LCDR3-Region konzentrieren (Abb. 5A, B). Ein bemerkenswertes Merkmal bei der Kryo-EM-Rekonstruktion des I2-Env-Komplexes ist die gut aufgelöste V1-Schleife mit einer veränderten Konfiguration. Eine gut aufgelöste Dichte wurde auch für das N137-Glykan der V1-Schleife beobachtet, das mit der S84R-Mutationsstelle der schweren I2-Kette in Kontakt kam (Abb. 5C und ergänzende Abb. 9A). Diese Mutation trat auch im I4-Intermediat auf, das ähnliche, wenn auch weniger klare Dichten für eine V1-Schleife zeigte, die mit dem V3-GDIK-Motiv gekoppelt war. Durch die Neuausrichtung der V1-Schleife wurde R57 in Richtung des V3-GDIK-Motivs verschoben, was zu seiner Wechselwirkung mit D325 führte (ergänzende Abbildung 9B). Diese V1-Schleifenorientierung ähnelte der UCA-gebundenen Trimerstruktur mit einem Knick in der Schleife, der eingeführt wurde, um R57 aufzunehmen (Abb. 5D). Die Quantifizierung der Antikörperorientierung zeigte eine Drehung des I2-VH/VL weg von der V1-Schleife, um dieser Schleifenumordnung Rechnung zu tragen (Abb. 5E).

Ein DH270-Klonbaum, der den intermediären Antikörper I4 und die reifen Antikörper DH270.2 (M2) und DH270.3 (M3) hervorhebt. B Draufsichten auf die Kontaktstellen DH270.2 und DH270.3. Alpha-Kohlenstoffe (Cα) von Mutationen der schweren und leichten Kette werden als Kugeln dargestellt. C (links) Ausrichtung (nur gp120) von I4- und DH270.2-gebundenen Zustandsstrukturen, die die Verschiebung in der Antikörperdisposition hervorhebt. (rechts) Ausrichtung (nur gp120) von I4- und DH270.3-gebundenen Zustandsstrukturen, die die Verschiebung in der Antikörperdisposition hervorhebt. D Theta-Phi-Diagramm für die Strukturen I4, DH270.2 und DH270.3. Die Farben der Datenpunkte stimmen mit den jeweiligen Farben der schweren Ketten in den Strukturen überein. E Strukturüberlagerung der N301-Glykane I4 und DH270.3, die ihre Änderung in der Anordnung und die Position der S27- oder Y27-Reste auf der leichten Kette des Antikörpers zeigt. F-Ausrichtung (nur gp120) von UCA+G57R- und DH270.3-gebundenen Zustandsstrukturen, was auf ähnliche Bindungszustandsanordnungen hinweist. G Vergleich der LCDR3-Kontaktstelle mit dem gp120-Protein und dem N301-Glykan zwischen den Strukturen I4 (oben) und DH270.3 (unten). H Vergleich der N332-Glykan-D1-Arm-Antikörperkontakte zwischen den Strukturen I4 (oben) und DH270.2 (unten).

Das I2-Intermediat und DH270.1 erwerben beide mehrere LCDR3-modifizierende Mutationen, wie sie in DH270.3 beobachtet wurden (Abb. 5F, G und ergänzende Abb. 9C, D). In DH270.1 traten mehrere Mutationen an der LCDR3-Base auf, die distal zum Epitop lagen, und zusammen stabilisierten sie wahrscheinlich die LCDR3-Region (ergänzende Abbildung 9E, F). Ähnliche Mutationen treten im I2-Intermediat auf, insbesondere eine F101C-Mutation räumlich neben der LCDR3-Base, die zur Bildung einer zusätzlichen Disulfidbindung im Antikörper zwischen den Resten 91 und 101 führt (ergänzende Abbildung 9D). Diese Mutation gehört zu den zuvor beschriebenen minimalen Mutationen, die erforderlich sind, um ~90 % der DH270.6-Breite zu erreichen29. Eine beträchtliche Anzahl von Mutationen in und mit Auswirkungen auf LCDR3 waren auch Teil des minDH270-Konstrukts und haben deutliche Auswirkungen auf die Epitop-Interaktion in der intermediär gebundenen I2-Struktur. Dazu gehörten VL Y93F, A94G und S97A, die zusammen mit VH G110Y eine Umlagerung in der LCDR3-Region bewirken und eine Tasche erzeugen, in der die N301-GlcNac-1-N-Acetyleinheit ruht (Abb. 5F). Ein wichtiger Einfluss der unwahrscheinlichen HCDR3-G110Y-Mutation auf die Entstehung dieser Tasche ist die Verschiebung des F93-Rotamers durch sterische Okklusion (Abb. 5G). Darüber hinaus tritt in DH270.1 eine HCDR3-Y106S-Mutation auf, die zu zwei Effekten führte. Erstens der Verlust einer Wasserstoffbindung zwischen der Seitenkette von Y106 und der Hauptkette von W101 und zweitens die Aufhebung der Wechselwirkung der Y106-Seitenkette mit dem N332-Glykan; Zusammen könnten diese dazu dienen, die Wechselwirkung von Glykan N332 mit HCDR3 zu modulieren, indem es ihm ermöglicht, die W101-Seitenkette effektiver zu binden (Abb. 5H). Diese Ergebnisse legen zusammen mit den beobachteten LCDR3-Änderungen in DH270.3 nahe, dass Modifikationen der Wechselwirkung an dieser Stelle für die Affinitätsreifung wesentlich waren.

Von der I2-Zwischenstufe aus teilt sich der Klon in zwei Pfade, die beide in einer ähnlichen Neutralisierungsbreite gipfeln, wobei DH270.6 jedoch die größte Wirksamkeit aufweist (Abb. 6A, B)20. Der obere Weg von I2 führt zum I1-Zwischenprodukt und dann zu den reifen DH270.4- und DH270.5-Antikörpern. Mutationen in dieser I1-Subklasse waren im Allgemeinen weiter von der interaktiven Antikörper-Antigen-Oberfläche entfernt und hatten weniger klare strukturelle Auswirkungen. In I1 könnten zwei Mutationen mit möglichen Auswirkungen auf die LCDR2-Schleife, N62H und R65W, die Wechselwirkungen zwischen N332 und Glykan-D1-Arm beeinflussen (Abb. 6C und ergänzende Abb. 10A). Diese Schleife konnte jedoch nur unzureichend aufgelöst werden, was unsere Fähigkeit einschränkte, zu bestimmen, welche Auswirkungen diese Mutationen gegebenenfalls haben. In DH270.4 ist eine VH-S85R-Mutation für die Interaktion mit dem N156-Glykan positioniert (Abb. 6D und ergänzende Abb. 10B). Allerdings ist diese Region, wie auch bei den I1-Zwischenmutationen, schlecht aufgelöst und die Wechselwirkung kann daher nicht bestätigt werden. Obwohl die Dichte des N301-Glykan-D-Arms nicht genau definiert war, erlitten die VH und VL von DH270.5 und DH270.6 mehrere Mutationen in der Nähe des N301-Glykan-D-Arms (Abb. 6E, F und ergänzende Abb. 10C, D). Im DH270.6-gebundenen Trimer waren Dichten erkennbar, die sowohl mit den V3-GDIK-gekoppelten als auch mit den nichtgekoppelten V1-Schleifenzuständen übereinstimmten (Abb. 6H und ergänzende Abb. 10E, F). Zusätzliche Mutationen in DH270.6 traten in der Nähe des N442-Glykans und der V1-Schleifenkonfiguration auf, die vom V3-GDIK-Motiv verdrängt wurde (Abb. 6G, H). Die Untersuchung dieser Strukturen weist darauf hin, dass Mutationen nach I2 hauptsächlich in Regionen auftraten, die weiter entfernt vom Epitop liegen, was mit der Fähigkeit von I2 übereinstimmt, die meisten durch DH270.6 neutralisierten Viren zu neutralisieren.

Ein DH270-Klonbaum, der die intermediären Antikörper I2 und I1 sowie die reifen Antikörper DH270.4 (M4), DH270.5 (M5) und DH270.6 (M6) hervorhebt. B Draufsichten auf die Kontaktstellen I1, DH270.4, DH270.5 und DH270.6. Alpha-Kohlenstoffe (Cα) von Mutationen der schweren und leichten Kette werden als Kugeln dargestellt. C Struktur der I1-VH/VL-Kontakte mit dem N332-Glykan-D1-Arm, die die Positionen der VL-N62H- und R56W-Mutationen zeigt. D Struktur der schweren Kette von DH270.4, die die Position eines möglichen Kontakts zwischen der S85F-Mutation und dem N156-Glykan zeigt. E Struktur der DH270.5 VH/VL-Mutationen proximal zum N301-Glykan. F Struktur der DH270.6 VH/VL-Mutationen proximal zum N301-Glykan. G Struktur der DH270.6-VL-Mutationen proximal zum N442-Glykan. H Die Struktur des DH270.6 VH zeigt zwei verschiedene Zustände der gp120 V1-Schleife.

Insgesamt ergab die Strukturbestimmung des gesamten DH270-Klons einen komplizierten Prozess, durch den die HIV-1-Neutralisierungsbreite im V3-Glykan-Supersite-gesteuerten DH270-Klon entwickelt wurde, wobei frühe unwahrscheinliche G57R- und S27Y-Mutationen des I5-Intermediats die Antikörperorientierung veränderten und eine heterologe Neutralisierung bewirkten Breite. Die Entwicklung zweier unterschiedlicher Kladen von I5 bis hin zu den I3- und I4-Zwischenprodukten führte dazu, dass beide eine Verbesserung der N332-Glykan-Wechselwirkung erzielten, was die Bedeutung der N332-Glykan-Interaktion für den DH270-Klon weiter unterstreicht. Jedes zielte jedoch auf bestimmte Stellen des Glykans ab, wobei I3 den distalen D1-Arm und I4 die GlcNac-Basis stabilisierte. Die nachfolgende Reifung von I4 zu DH270.2 legt nahe, dass dies keine ideale Lösung für den Erwerb der N332-Glykan-Wechselwirkung war, da DH270.2 Mutationen wie die in I3 für den N332-Glykan-D1-Arm erwirbt. Post-I3, das zu I2 und DH270.1 zusammen mit DH270.3 führt, weist alle eine beträchtliche Anzahl von Mutationen im LDCR3 und angrenzenden Resten auf. Während DH270.3 mehrere Mutationen erwirbt, die für die Neutralisierung entscheidend sind, darunter G110Y und S94A, könnte die Auswahl der Y27S-Reversion seine Breite eingeschränkt haben. Wo DH270.1 stabilisierende LCDR3-Mutationen erwarb, modifizierte I2, das eine beträchtliche Neutralisierungsbreite entwickelte, die LCDR3-Konformation und stabilisierte einen N301-Glykanbase-Kontaktpunkt. Dies wurde durch mindestens fünf Reste vermittelt, von denen jeder für sich möglicherweise einen begrenzten Affinitätsgewinn bewirkt hat. Hätte DH270.3 zunächst den N332-Glykan-D1-Arm stabilisiert, wären die begrenzten Gewinne im Zusammenhang mit der Optimierung der LCDR3-Stelle möglicherweise beherrschbar gewesen. Paratopmodifikationen stromabwärts des I2-Intermediats waren vom primären Epitop entfernt und dienten wahrscheinlich der Feinabstimmung von Affinität, Breite und Wirksamkeit. Der minDH270-Antikörper29 erforderte nur Mutationen von I5 bis I2, was mit dieser Beobachtung übereinstimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Selektion während der Affinitätsreifung auf eine Reihe struktureller Engpässe eingegrenzt werden kann, wobei der sich entwickelnde Antikörperklon optimale und suboptimale Lösungen zeigt, wenn sich der Klon in verschiedene Pfade aufspaltet.

Die Entwicklung der HIV-1-Neutralisierungsbreite im DH270-Klon erfolgte vor dem Hintergrund der Koevolution mit dem Virus, wobei wesentliche Veränderungen im Env-Protein die Antikörperreifung vorantreiben und umgekehrt20. Wir untersuchten zunächst, wie sich das DH270-Epitop während der Infektion bei der mit CH848 HIV-1 infizierten Person entwickelte (ergänzende Abbildung 11). Die ersten DH270-Klon-Antikörper traten zwischen 793 und 1304 Tagen nach der Infektion auf, was mit einer Verringerung der Schleifenlänge von Env V1 um 18–19 Aminosäuren und einer G300N-Substitution in Env an einer Stelle in der Nähe des DH270-Epitops zusammenfiel, die am Tag 699 nach der Infektion auftrat -Infektion (Abb. 7A). Die frühen I5- und I3-Intermediate erkennen nur die Envs, die diese kürzeren V1-Schleifen und die G300N-Mutation beherbergen. In Übereinstimmung mit der Env-Selektion, die durch die früheren DH270-Klon-Antikörper I5 und I3 (ergänzende Abbildung 12A) gesteuert wird, treten autologe Viren mit längeren V1-Schleifen und G300 1304–1431 Tage nach der Infektion wieder auf. Die Fähigkeit des DH270-Klons, Viren sowohl mit längeren V1-Schleifenlängen als auch mit G300 zu neutralisieren, zeigt sich am I2-Intermediat (Abb. 7A, ergänzende Abb. 12). Die Erkennung längerer V1-Schleifen und Rest-300-Mutationen in CH848-Quasispezies spiegelt sich auch in der DH270-Antikörpererkennung heterologer Viren mit diesen Merkmalen wider, was zur größeren Breite von I2 und DH270.6 im Vergleich zu I5 und I320 beiträgt.

Eine Zeitleiste der Antikörper- und Env-Koevolution. Die oberen Kästchen zeigen an, ob Envs zu jedem Zeitpunkt empfindlich (grün) oder resistent gegen frühe Zwischenprodukte (oben) und spätere Zwischenprodukte/reife (unten) klonale Mitglieder sind. Infektionsperioden, in denen lange V1-Schleifen dominieren, sind grau dargestellt, wobei wichtige Mutationszeitpunkte entlang der Zeitachse hervorgehoben sind. Env-Strukturen wurden für Sequenzen bestimmt, die an den Tagen 358, 526, 836 und 949 nach der Infektion isoliert wurden und auf der Zeitachse hervorgehoben waren, wobei der Zeitraum, in dem der D270-Klon erschien, hervorgehoben war. B (links) Seitenansicht eines einzelnen gp120/gp41-Protomers mit Hervorhebung des V1- und V3-GDIR/K-Motivs. (rechts) V1-Schleifenstrukturen jedes Env-Isolats. C (links) Draufsicht eines einzelnen gp120/gp41-Protomers mit Hervorhebung des V1- und V3-GDIR/K-Motivs. Karten und Strukturanpassungen für die Strukturen ohne Liganden d358 (Mitte links), unliganden d949 (Mitte rechts) und I3-gebundenen d949 (rechts). D Die an I3 (links) und I2 (rechts) gebundenen Strukturen zeigen Ähnlichkeit in der Epitopkonformation. E Die an DH270.6 gebundene d526-Struktur (links) und die an DH270.6 gebundene d949-Struktur (rechts) zeigen Ähnlichkeit in der Epitopkonformation.

Basierend auf diesen beiden frühen intermediären Resistenzmerkmalen wählten wir Envs von den Tagen 358 und 526 aus, die sowohl G300 als auch lange hypervariable V1-Schleifen mit 18 bzw. 28 Aminosäuren aufwiesen, und Envs von den Tagen 836 und 949, die sowohl N300 als auch kurze hypervariable V1-Schleifen aufwiesen Schleifen aus 11 Aminosäuren, um strukturelle Hürden für die Interaktion mit DH270-Antikörpern zu identifizieren. Wir untersuchten zunächst die Bindung der Klonantikörper an jede Env-SOSIP-Ektodomäne mittels ELISA (ergänzende Abbildung 13). In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen zeigte die UCA nur eine Bindung an das d949-Konstrukt, während I5 die d949- und die d836-Konstrukte band. Während I3 eine Bindung an das d358-Konstrukt zeigte, war dies bei I4 nicht der Fall. In Übereinstimmung mit den Unterschieden in der frühen Reifung dieser Klone banden die reifen DH270.2- und DH270.3-Antikörper im Vergleich zu I2, I1 und DH270.4-6 schwächer an das d358-Konstrukt. Weder DH270.2 noch DH270.3 banden an das d526-Konstrukt, während eine messbare Bindung an I2, I1 und DH270.4-6 beobachtet wurde, obwohl die Wechselwirkung schwächer war als bei den anderen drei Konstrukten. Trotz der geringen Sequenzähnlichkeit zeigte die Untersuchung der V1-Schleifenregionen jeder Env-Struktur ohne Liganden einen strukturell konservierten hydrophoben Kern und variable Wasserstoffbrückenbindungen und/oder Salzbrückenbildung, die die Kopplung der V1-Schleife an das V3-GDIR/K-Motiv gewährleisten. Das d358 Env V1 zeigte in einem Teil der Schleife eine erhebliche Unordnung mit flankierenden hydrophoben und Salzbrückenwechselwirkungen, die sicherstellten, dass die Schleife über dem V3-GDIR/K-Motiv geschlossen blieb (Abb. 7B und ergänzende Abb. 14A). Der d526 Env enthielt einen ähnlichen hydrophoben Kern und zeigte trotz seiner längeren Länge mehr Ordnung. Dies war auf die direkte Wechselwirkung der V1-Schleife mit dem nahegelegenen N332-Glykan zurückzuführen (Abb. 7B und ergänzende Abb. 14B). Die d836- und d949-Env-V1 waren deutlich kürzer, behalten aber immer noch die gekoppelte Position des hydrophoben Kerns und des V3-GDIR/K-Motivs der früheren Viren bei (Abb. 7B und ergänzende Abb. 15). Die d836-Schleife zeigte einen Knick in der Schleife in der Nähe des V3-GDIR/K-Motivs, was zu einer etwas stärkeren Belichtung des Motivs führte (Abb. 7B und ergänzende Abb. 15C). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine gemeinsame Rolle von V1 beim Schutz des neutralisierungsempfindlichen V3-GDIR/K-Motivs hin, die durch einen konservierten hydrophoben Kern vermittelt wird.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkung der Env G300N-Substitution, die mit der Kloninitiierung verbunden ist, auf das DH270-Epitop. Das V3-GDIR/K-Motiv liegt proximal zur Position 300 und bildet eine paarweise gebrochene Beta-Faltblatt-Sekundärstruktur. Eine visuelle Untersuchung des V3-GDIR/K-Motivs in den G300-haltigen d358- und d526-Env-Karten deutete auf eine größere Unordnung in der gebrochenen Blattstruktur im Vergleich zu der der N300-haltigen d836- und d949-Env-Karten hin (Abb. 7C). N300 bildete im ungebundenen Zustand einen Wasserstoffbrückenbindungskontakt mit dem I326-Rückgrat des V3-GDIK-Motivs. Diese Wechselwirkung bleibt in den gebundenen Zustandsstrukturen für die frühen Zwischenprodukte erhalten, wobei sich die Konformation des V3-GDIK-Motivs kaum ändert (Abb. 7C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass G300N das DH270-Epitop stabilisierte und es dem UCA und frühen Zwischenprodukten ermöglichte, das Virus zu binden und zu neutralisieren. Mutationen am Rest N300 beginnen 1431 Tage nach der Infektion aufzutreten (ergänzende Abbildung 11), zu diesem Zeitpunkt zirkulieren Glycin- und Tyrosinvarianten gemeinsam mit Asparaginvarianten. Dies geschieht ungefähr zu der Zeit, zu der die LCDR3-Mutationen in der Nähe des Env-Restes 300 in I2, DH270.1 und DH270.3 auftreten, was darauf hindeutet, dass das sich entwickelnde Virus für diese Mutationen im Klon ausgewählt wurde. Ein Vergleich der Env-gebundenen I3- und I2-Strukturen zeigte insgesamt nur eine geringe Änderung ihrer Epitopkonfiguration (Abb. 7D). Darüber hinaus zeigen Strukturen von DH270.6, die an d526-Env mit G300 und d949-Env mit N300 gebunden sind, nur wenige Änderungen in der gesamten Epitopkonformation (Abb. 7E und ergänzende Abb. 14B). Da der Haupteffekt der LCDR3-Mutationen eine Versteifung des LCDR3 und ein engerer Kontakt mit der N301-Glykan-Base war, wobei sich die Konfiguration des gebundenen Zustands im unligierten oder gebundenen Zustand kaum änderte, verstärkten diese Mutanten wahrscheinlich die Wechselwirkung, indem sie die erhöhte Epitopflexibilität kompensierten . Zusätzliche koevolvierende Env-Stellen außerhalb der V1-Schleife und Position 300 umfassten die Positionen 325 bis 327 im 324GDIR/K327-Motiv und Position 328 (ergänzende Abbildung 11 rechts). Es traten auch Mutationen auf, die ab 1304 Tagen nach der Infektion die Glykansequenzen N301, N332 und N442 eliminierten. Autologe Viren, die gegen das reife DH270.4 resistent waren, waren überwiegend für die D325N-Substitution angereichert, wiesen aber auch einen Glykanverlust bei 301, 332 und/oder 442 auf. Ein klarer struktureller Einfluss für D325N wurde bei allen engen Kontakten nicht beobachtet Strukturen mit den Glykanen legen nahe, dass ihr Verlust tatsächlich große Auswirkungen auf die Bindung des DH270-Antikörpers hätte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Virusentwicklung die klonale Evolution von DH270 initiierte, indem sie das GDIR/K-Epitop durch G300N stabilisierte und den langen V1-Loop-Schutz des konservierten V3-Loop-V3-GDIR/K-Motivs entfernte. Die Rückkehr dieser Schutzmerkmale hat wahrscheinlich die Reifung des Klons in Richtung einer Stabilisierung des Paratops vorangetrieben, um einer erhöhten Flexibilität entgegenzuwirken, was zu einer größeren Neutralisierungsbreite führte.

Hier haben wir eine Reihe von Kryo-EM-Strukturen untersucht und sie mit dem Ergebnis der Antikörperaffinität in einem Prototyp eines V3-Glykan-HIV-1-Antikörper-B-Zellklons korreliert. Wir haben gezeigt, dass die frühen G57R- und S27Y-Mutationen, die für den Erwerb heterologer Breite durch den I5-Zwischenantikörper erforderlich waren, die Antikörperorientierung relativ zu Env veränderten, und diese Verschiebung der Antikörperposition wirkte sich wahrscheinlich auf die nachgelagerte Antikörperentwicklung aus. Die nächsten Schritte bei der Affinitätsreifung von DH270.6 umfassten die Optimierung der Wechselwirkungen mit dem N332-Glykan, wobei sowohl die I3- als auch die I4-Zwischenprodukte Mutationen rund um die N332-Glykan-Wechselwirkung erwerben, wenn auch auf verschiedene Arme des verzweigten Glykans abzielend. Die Reifung von I4 zu DH270.2 beinhaltete den Erwerb von Mutationen in der Nähe des N332-Glykan-D1-Arms wie denen in I3, was darauf hindeutet, dass die Einbeziehung des D1-Arms anstelle des D2/3-Arms eine bessere Lösung zur Optimierung der N332-Glykan-Wechselwirkung darstellt. Wenn DH270.2 zeigt, dass die I4-Auswahl nicht ideal war, zeigt DH270.3 das Problem, wenn man von einem kritischen Punkt zu früh abweicht. Nach I3 zeigte die Entwicklung zu I2 und DH270.1 zusammen mit DH270.3 alle eine beträchtliche Anzahl von Mutationen im LDCR3 und angrenzenden Resten, wobei I2 die größte Neutralisierungsbreite und -stärke erlangte. Die Paratopmodifikation stromabwärts des I2-Intermediats erschien weiter vom primären Epitop entfernt und wirkte sich wahrscheinlich auf die Feinabstimmung von Affinität, Breite und Wirksamkeit aus. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine abgestufte, ortsspezifische Entwicklung das Schicksal der nachgeschalteten klonalen Affinitätsreifung von DH270 bestimmte.

Eine kürzlich durchgeführte Studie eines breit neutralisierenden Influenza-Hämagglutinin-abzielenden Antikörper-B-Zellklons legt nahe, dass die Affinitätsreifung die Entwicklung eines vielfältigen Pools potenzieller Lösungen beinhaltet, aus denen eine weitere Optimierung eine breite Reaktion hervorrufen könnte4. Im Einklang mit dieser Studie stellten wir hier fest, dass unterschiedliche Mutationen ähnliche Probleme des Erregers lösten. Diese Lösungen waren jedoch nicht unbedingt gleichermaßen wirksam, und der sich entwickelnde Klon schien sich in Richtung optimaler Lösungen zu entwickeln, um Affinität zu gewinnen, was durch die Ähnlichkeit der Kladenmutationen belegt wurde. Was diese Antikörper-„Pluripotenz“-Hypothese stützt, die auf der Grundlage eines Influenza-bnAb4 entwickelt wurde, stellt ein schwieriges Problem für die Impfstoffentwicklung dar. Da bestimmte Endpunkte in Klonen aufgrund ihrer Breite und Wirksamkeitseigenschaften erwünscht sind, ist wahrscheinlich eine sorgfältige Steuerung der Entwicklungsreaktionen auf diese Endpunkte und weg von weniger produktiven Lösungen für die Neutralisierungsbreite erforderlich.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass Lösungen für Epitop-Paratop-Paarungsprobleme nicht gemeinsam auftraten, sondern zu einer Kladendiversifizierung führten. Aus der Perspektive des gesamten DH270-Klons wird die weitere Affinitätsreifung eingeschränkt, wenn es nicht gelingt, eine optimale Lösung zu finden, wie es bei den klonalen Mitgliedern DH270.1 und DH270.3 der Fall war. Wenn es daher nicht gelingt, zu Beginn der Reifung der bnAb-Linie optimale Lösungen für die Antigenerkennung an bestimmten Problemstellen zu finden, kann dies eine günstige Entwicklungsneutralisierungsbreite bei späteren Linienmitgliedern behindern. Im Zusammenhang mit dem DH270-Klon kann eine Impfung, die die Selektion der I5-G57R- und S27Y-Mutationen nicht induziert, den Erwerb der I3-R98T- und L48Y-Mutationen einschränken. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, wie der DH270-Klon unterschiedliche Wege einschlug, um zu Lösungen zu gelangen, die sich in der Breite der HIV-1-Neutralisierung erheblich unterschieden. Wenn wir wissen, welche Epitopstellen an der Auswahl von Mutationen mit besserer Neutralisierungsbreite beteiligt sein könnten, sind wir besser in der Lage, Immunogenmodifikationen präzise auszuwählen, die einen positiven differentiellen Affinitätsgewinn zugunsten der gewünschten Mutation(en) bewirken würden. Im Gegensatz zu I3, das zwei kritische Mutationen enthielt, die wahrscheinlich einzeln zu einem Affinitätsgewinn führten, erwarb I2 mehrere LCDR3-Mutationen, die zusammenarbeiteten, um die Interaktion mit dem Env zu modifizieren. Die Notwendigkeit, mehrere Mutationen zu induzieren, die möglicherweise wenig zur individuellen Verbesserung der Affinität beitragen, wird wahrscheinlich erfordern, über die Immunogeneigenschaften hinaus über Fragen im Zusammenhang mit Adjuvans, Impfzeitpunkt sowie der Anzahl und Identität der verstärkenden Immunogene nachzudenken.

Während sich unsere Studie auf den Reifungsweg eines einzelnen V3-Glykan-Targeting-bnAb-Klons konzentriert, bestehen mehrere Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen V3-Glykan-Targeting-Antikörpern. Während spezifische Details ihrer Reifungspfade unterschiedlich sein können, müssen Antikörper, die auf diese Stelle abzielen, ähnliche strukturelle Barrieren umgehen, um zu optimalen Lösungen für die Erlangung einer heterologen Neutralisierungsbreite zu gelangen. Zu den wichtigsten strukturellen Barrieren gehören die V1-Schleife, die die sich entwickelnden Antikörper umgehen müssen, um auf das konservierte V3-GDIR/K-Motiv zuzugreifen, und die Epitop-Glykane, vor allem das N332-Glykan. Tatsächlich definiert die Fähigkeit, diese beiden Strukturmotive gleichzeitig zu erkennen, einen V3-Glykan-bnAb oder einen Vorläufer. Der DH270-Klon zeigt, dass diese Epitopstellen schon früh in der klonalen Entwicklung beteiligt sind, wobei die DH270-UCA bereits in einer Ausrichtung ist, die das N332-Glykan umfasst. Der nächste Schritt in der Entwicklung ist der Erwerb der VH-G57R-Mutation zur Aktivierung des V3-GDIK Motiv. Daher ist die innerhalb des V3-GDIR/K-Motivs und des N332-Glykans eingeklammerte Antikörperorientierung, selbst in frühen Stadien der klonalen Entwicklung, in denen möglicherweise keine oder nur eine geringe Neutralisierungsbreite beobachtet wird, eine wichtige strukturelle Signatur eines V3-Glykan-Antikörpers, zu dem sich möglicherweise entwickeln kann Erwerben Sie eine heterologe Neutralisationsbreite. Dies steht im Gegensatz zu anderen räumlich proximalen HIV-1-Env-Apex-Antikörpern, die auf autologe Antikörper abzielen, die das V3-GDIR/K-Motiv, aber nicht das N332-Glykan angreifen31,32,33.

Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass ein wirksamer HIV-1-Impfstoff die Auslösung einer polyklonalen bnAb-Reaktion erfordert, die auf mehrere Env-Anfälligkeitsstellen abzielt26. Ein Weg zur Bewältigung dieser schwierigen Aufgabe besteht darin, Immunogene zu entwickeln, die nach bekannten bnAb-Mutationen in Keimbahn-Vorläufer-B-Zellen selektieren können. Die Kartierung der Antikörper-bnAb-Entwicklung in dieser Studie liefert einen Fahrplan für eine solch präzise, ​​klonbasierte Immunogenentwicklung. Durch die Isolierung verschiedener Strukturelemente an der Antikörper-Antigen-Grenzfläche können Gewinnstellen etabliert und Immunogene entwickelt werden, um nacheinander strukturelle Probleme zu lösen, die mit jeder Stelle einzeln verbunden sind. Durch die Verlagerung des Fokus auf spezifische, überschaubare Schritte kann das rationale Affinitätsdesign über eine Reihe genau definierter Ziele erfolgen, anstatt zu versuchen, einen spekulativen Satz endgültiger Immunogendesigns zu implementieren, denen klare Daten fehlen.

Statistische Schlussfolgerungen spielen eine Schlüsselrolle bei unserer Untersuchung der Koevolution von DH270-Abstammungsantikörpern und CH848 HIV-1 Env. Die Rekonstruktion des klonalen Antikörperbaums verwendet eine auf maximaler Wahrscheinlichkeit basierende statistische Inferenz, um die Antikörpersequenzen interner Knoten abzuschätzen, die die Vorfahrenzustände des B-Zellklons darstellen. Die Genauigkeit dieser Methode wird durch die verfügbaren Sequenzdaten, die für den Klon abgetastet wurden, und das verwendete Evolutionsmodell begrenzt. Daher stellt der hier und in anderen Studien8,34 verwendete Klonbaum für den DH270-Klon die beste Schätzung angesichts der Standardparameter des Cloanalyty-Programms35 und der Sequenzdaten der 6 gepaarten schweren und leichten Ketten des DH270-Klons dar, die durch Antigen gewonnen wurden. spezifische Sortierung einzelner B-Zellen. Auch unsere longitudinale Env-Sequenzanalyse hängt von statistischen Schlussfolgerungen und der Beziehung zwischen der Virusneutralisierung klonaler Linienmitglieder und der Wahrscheinlichkeit ab, dass ein bestimmtes Env-Merkmal für Antikörperveränderungen ausgewählt wird, die die Atmung verbessern. Unsere Berichterstattung über die strukturellen Auswirkungen von Antikörpermutationen der DH270-Linie und spezifische Env-Mutationseffekte im Kontext der Koevolution hängt daher von der Richtigkeit dieser Schlussfolgerungen ab. Darüber hinaus ist die genaue Env-Sequenz, die die Abstammungslinie initiierte, und die Anzahl der verschiedenen Sequenzen, die die Entwicklung der klonalen Abstammungslinie DH270 vorangetrieben haben, nicht bekannt.

Während während der natürlichen Koevolution gleichzeitig Veränderungen im Virus und im Antikörperklon auftraten, basieren die meisten unserer Strukturbeobachtungen auf der Verwendung eines einzelnen Env, einem löslichen SOSIP-Trimer, das von einem Virus stammt, das am Tag 949 danach aus dem CH848-Individuum isoliert wurde Übertragung. Obwohl dies eine getreue strukturelle Nachbildung des Koevolutionsprozesses ausschloss, ermöglichte es uns, den Datensatz überschaubar zu halten und gleichzeitig aussagekräftige Einblicke in die Koevolution zu gewinnen, indem wir uns auf spezifische Änderungen der Env-Reste konzentrierten, die für die Entstehung von Widerstand und das Fahren entscheidend waren Antikörperentwicklung. Unsere Strategie ermöglichte es uns, die Auswirkungen von Veränderungen der Antikörperreste zu untersuchen, ohne durch gleichzeitige Veränderungen in Env beeinträchtigt zu werden. Schließlich fügten wir weitere Einblicke in die Koevolution hinzu, indem wir ausgewählte Envs mit unterschiedlichen Neutralisierungseigenschaften und strukturellen Barrieren für die Antikörperbindung untersuchten, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten auftraten.

Expi293-Zellen (ThermoFisher Kat.-Nr. A14527) wurden auf ein Endvolumen von 0,5 l bei einer Konzentration von 2,5 × 106 Zellen ml-1 in Expi293-Medium verdünnt. Vierhundert Mikrogramm Schwerketten- und Leichtketten-Plasmid wurden mit Expifectamine (ThermoFisher Kat.-Nr. A14526) komplexiert und den Expi293-Zellen zugesetzt. Am fünften Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation und 0,8 μM-Filtration aus dem Transfektionszellkulturmedium entfernt. Der rekombinante Antikörper enthaltende Überstand wurde über Nacht bei 4 °C mit Protein-A-Harz (ThermoFisher) inkubiert. Das Protein-A-Harz wurde durch Zentrifugation gesammelt und der Kulturüberstand entfernt. Das Harz wurde mit 25 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, die insgesamt 340 mM NaCl enthielt. Insgesamt 30 ml 10 mM Glycin, pH 2,4, 150 mM NaCl wurden verwendet, um den Antikörper vom Protein-A-Harz zu eluieren. Der pH-Wert der eluierten Antikörperlösung wurde durch Zugabe von 1 M Tris pH 8,0 auf etwa 7 erhöht. Die Antikörperlösung wurde durch aufeinanderfolgende Zentrifugationsrunden in PBS gepuffert, filtriert und bei –80 °C gelagert.

Die Herstellung der CH848 SOSIP gp140-Hülle wurde mit Freestyle293-Zellen (ThermoFisher Kat.-Nr. R79007) durchgeführt. Am Tag der Transfektion wurde Freestyle293 mit frischem Freestyle293-Medium auf 1,25 × 106 Zellen/ml verdünnt, bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l. Die Zellen wurden mit 650 μg SOSIP-exprimierender Plasmid-DNA und 150 μg Furin-exprimierender Plasmid-DNA, komplexiert mit 293Fectin (ThermoFisher Cat No. 12347019), co-transfiziert. Am 6. Tag wurden Zellkulturüberstände durch 30-minütige Zentrifugation der Zellkultur bei 3500 U/min geerntet. Der zellfreie Überstand wurde durch einen 0,8-μm-Filter filtriert und mit einer Einweg-Tangentialflussfiltrationskassette auf weniger als 100 ml konzentriert und erneut 0,8 μm filtriert. Trimeres Env-Protein wurde mit der Affinitätschromatographie des monoklonalen Antikörpers PGT145 gereinigt. PGT145-gekoppeltes Harz wurde in eine Tricorn-Säule (GE Healthcare) gepackt und in PBS, ergänzt mit 0,05 % Natriumazid, gelagert. Zellfreier Überstand wurde mit einem AKTA Pure (GE Healthcare) mit 2 ml/min auf die Säule aufgetragen, gewaschen und das Protein mit 3 M MgCl2 von der Säule eluiert. Das Eluat wurde sofort in 10 mM Tris, pH 8, verdünnt, 0,2 μm filtriert und zur Größenausschlusschromatographie auf 2 ml konzentriert. Die Größenausschlusschromatographie wurde mit einer Superose 6 16/600-Säule (GE Healthcare) in 10 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl durchgeführt. Fraktionen, die trimeres HIV-1-Env-Protein enthielten, wurden gepoolt, sterilfiltriert, eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Die SPR-Bindungskurven der Fabs der DH270-Linie gegen CH848 DS SOSIP Trimer wurden entweder mit einem Biacore S200-Instrument (Cytiva) in HBS-N 1× Laufpuffer oder einem Biacore 3000-Instrument (Cytiva) in PBS 1× pH7,4 erhalten. Für die Affinitätsmessungen der DH270 Fabs I5.6, I3.6, I2.6 und DH270.6 wurde biotinyliertes CH848 DS SOSIP Trimer über Streptavidin auf einem CM3-Sensorchip in einer Menge von 280–290 RU immobilisiert. Unter Verwendung des Einzelzyklus-Injektionstyps wurden sechs aufeinanderfolgende Injektionen der von 50 auf 1500 nM verdünnten Fabs mit 50 µL/min für 120 s pro Konzentration über das immobilisierte SOSIP-Trimer injiziert, gefolgt von einer Dissoziationsperiode von 600 s. Die Fabs wurden mit einem 20-s-Puls von 25 mM NaOH bei 50 µL/min regeneriert. Die Ergebnisse wurden mit der Biacore S200 Evaluation Software (Cytiva) analysiert. Eine leere Streptavidin-Oberfläche sowie Pufferbindung wurden für die doppelte Referenzsubtraktion verwendet, um unspezifische Antikörperbindung und Signaldrift zu berücksichtigen. Kurvenanpassungsanalysen wurden unter Verwendung des 1:1-Langmuir-Modells mit einem lokalen Rmax durchgeführt. Für DH270UCA3 Fab wurde biotinyliertes CH848 DS SOSIP Trimer über Streptavidin bis zu einer Konzentration von 290–300 RU auf einem CM5-Sensor immobilisiert. DH270UCA3 Fab wurde von 500 auf 3000 nM verdünnt und jede Konzentration wurde 300 s lang über die SOSIP-Trimer-Oberfläche unter Verwendung des K-inject-Injektionstyps mit 50 µL/min injiziert. Auf eine Dissoziationsperiode von 600 Sekunden folgte eine Oberflächenregeneration mit einem 20-sekündigen Impuls von 50 mM NaOH. Die Ergebnisse wurden mit der BIA-Auswertungssoftware (Cytiva) analysiert. Für die doppelte Referenzsubtraktion wurden eine leere Streptavidin-Oberfläche und Pufferbindung verwendet. Die Kurvenanpassungsanalyse von DH270UCA3 Fab wurde unter Verwendung des 1:1-Langmuir-Modells mit einem lokalen Rmax durchgeführt. Die gemeldeten Bindungskurven für alle Fabs sind repräsentativ für einen Datensatz.

Die CH848-SOSIP-Trimerkomplexe wurden unter Verwendung einer Stammlösung von 2 mg/ml Trimer, inkubiert mit einem sechsfachen molaren Überschuss an Fab, hergestellt. Um die Wechselwirkung der Trimerkomplexe mit der Luft-Wasser-Grenzfläche während der Vitrifizierung zu verhindern, wurden die Proben in 0,085 mM n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) inkubiert. Die Proben wurden auf plasmagereinigte QUANTIFOIL-Lochkohlenstoffgitter (EMS, R1,2/1,3 Cu 300 Mesh) aufgetragen, gefolgt von einer 30-sekündigen Adsorptionsphase und dem Abtupfen mit Filterpapier. Das Gitter wurde dann in flüssigem Ethan unter Verwendung eines EM GP2-Tauchfrosters (Leica, 90–95 % relative Luftfeuchtigkeit) tauchgefroren.

Die Kryo-EM-Bildgebung wurde mit einem FEI Titan Krios-Mikroskop (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, das bei 300 kV betrieben wurde. Datenerfassungsbilder wurden mit einem Falcon 3EC- oder K3-Direktelektronendetektor im Zählmodus mit einer kalibrierten physikalischen Pixelgröße von 1,08 Å und einem Defokusbereich zwischen –1,0 und –3,5 µm unter Verwendung der EPU-Software (Thermo Fisher Scientific) aufgenommen. Am Mikroskop war kein Energiefilter oder Cs-Korrektor installiert. Die verwendete Dosisrate betrug ∼0,8 e-/Å2 s, um den Betrieb im linearen Bereich des Detektors sicherzustellen. Die Gesamtbelichtungszeit betrug 60 s, und alle 2 s wurden Zwischenbilder aufgezeichnet, was einer Gesamtdosis von ∼42 e-/Å2 und insgesamt 30 Bildern pro Bild entspricht.

Die Qualität der Kryo-EM-Bilder wurde während der Datenerfassung mithilfe automatisierter Verarbeitungsroutinen im laufenden Betrieb überwacht. Für die Datensätze DH270.I3, DH270.I2, DH270.6, DH270.I4 und DH270.2 wurde die Datenverarbeitung innerhalb von cryoSPARC36 durchgeführt, einschließlich Partikelauswahl, mehreren Runden der 2D-Klassifizierung, Ab-initio-Rekonstruktion, homogener Kartenverfeinerung und Nicht- einheitliche Kartenverfeinerung. Der Rest der Datensätze wurde außerhalb von cryoSPARC weiterverarbeitet, um die Kartenqualität zu verbessern, wie im Folgenden beschrieben. Die Filmbildausrichtung wurde mit UNBLUR37 und die CTF-Bestimmung mit CTFFIND438 durchgeführt. Die Partikel wurden automatisch ausgewählt, wobei als Suchvorlage eine Gaußsche Scheibe mit einem Radius von 80 Å verwendet wurde. Alle ausgewählten Partikel wurden mit einer Boxgröße von 384 Pixeln extrahiert und auf 192 Pixel herunterskaliert (Binning 2) und 8 Verfeinerungsrunden in cisTEM39 unter Verwendung eines mit cryoSPARC36 generierten Ab-initio-Modells unterzogen. Die Verteilung der von cisTEM jedem Partikel zugewiesenen Bewertungen zeigte eine klare bimodale Verteilung und nur Partikel in der Gruppe mit den höheren Bewertungen wurden für die weitere Verarbeitung ausgewählt. Die saubere Teilmenge der Partikel wurde ohne Binning erneut extrahiert und 10 Iterationen einer lokalen Verfeinerung unterzogen, gefolgt von 5 zusätzlichen Iterationen unter Verwendung einer mit EMAN240 generierten Formmaske. Anschließend wurde eine CTF-Verfeinerung pro Partikel durchgeführt, bis keine weitere Verbesserung der FSC-Kurve mehr beobachtet wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Partikelbilder erneut aus den Rohdaten extrahiert und einer Bewegungskorrektur pro Partikel unter Verwendung aller Filmbilder und unter Anwendung eines datengesteuerten Dosisgewichtungsschemas unterzogen41. Die neuen lokal ausgerichteten Partikel wurden nach cryoSPARC exportiert, um eine zusätzliche Runde homogener Verfeinerung und ungleichmäßiger Verfeinerung durchzuführen.

Für die Ellbogenwinkelanalyse mit DH270.I3, I4 und DH270.5 wurde in cryoSPARC eine lokale Fokusverfeinerung mit den sauberen Partikeln nach der Symmetrieerweiterung durchgeführt. Anschließend wurden die Partikel zusammen mit den entsprechenden Verfeinerungsparametern in RELION 3.142 exportiert, um eine 3D-Klassifizierung ohne Ausrichtung mit T=25 durchzuführen.

Die Strukturen jedes Antikörpers wurden mit Modeller43 und verfügbaren Fab-Kristallstrukturen20,30 erstellt. Die SOSIP-Env-Strukturen wurden mit dem Modeler und dem DH270.6-gebundenen CH848-Tag-949-Trimer (PDB-ID 6UM6, Ketten A und B)21 hergestellt. Koordinaten für VRC01 aus PDB-ID 3NGB44 (Ketten H und L). Die Strukturanpassung der Kryo-EM-Karten wurde in ChimeraX45 unter Verwendung der Isolde-Anwendung46 durchgeführt. Die Statistiken zur Strukturanpassung und Kartenqualität wurden mit MolProbity47 bzw. EMRinger48 ermittelt. Die Glykane wurden mithilfe einer Kombination aus geschärften und Gauß-gefilterten Karten (1,0–1,5 Standardabweichung) angepasst. Struktur- und Kartenanalysen wurden mit einer Kombination aus PyMol49 und ChimeraX durchgeführt, wobei die Theta- und Phi-Winkel mit VMD50 berechnet wurden. Elektrostatische Potentialkarten wurden in PyMol erstellt.

Die Antikörperbindung an SOSIP-Proteine ​​wurde unter Verwendung von ELISA-Platten mit 384 Vertiefungen getestet, die über Nacht bei 4 °C mit 2 µg/ml Antikörper in 0,1 M Natriumbicarbonat beschichtet wurden. Die Platten wurden mit PBS/0,05 % Tween-20 gewaschen und mit Assay-Verdünnungsmittel (PBS mit 4 % (w/v) Molkenprotein/15 % normales Ziegenserum/0,5 % Tween-20/0,05 % Natriumazid) bei Raumtemperatur blockiert 1 Std. Gereinigtes SOSIP-Protein wurde in zweifachen Reihenverdünnungen, beginnend bei 10 µg/ml, 1 Stunde lang zugegeben und anschließend gewaschen. Die Bindung von SOSIP an die beschichteten Antikörper wurde unter Verwendung des biotinylierten menschlichen Antikörpers PGT151 bei 0,125 µg/ml für 1 Stunde nachgewiesen. PGT151 wurde gewaschen und anschließend 1 Stunde lang mit Streptavidin-HRP (Thermo Scientific Nr. 21130) 1:30.000 behandelt. Die Platten wurden viermal gewaschen und mit TMB-Substrat (SureBlue Reserve – Nr. 5120-0083) entwickelt, gefolgt von 1 M HCl, um die Reaktion zu stoppen. Schließlich wurde die Absorption bei 450 nm (OD450) mit einem 384-Well-Plattenlesegerät (Molecular Devices, Spectramax 384 plus) bestimmt.

Die für die Signaturanalyse verwendeten Env-Sequenzen stammen von Bonsignori et al.20. Zur Generierung von Sequenzlogos wurde das Webtool AnalyzeAlign der Los Alamos HIV Database verwendet. Die autologen Neutralisationsdaten stammen von Bonsignori et al.20. gemessen an 90 autologen Env-Pseudoviren, einschließlich des TF und repräsentativen longitudinalen Envs, die zwischen 78 und 1720 Tagen nach der Infektion beprobt wurden. Während in der vorherigen Studie Intermediate mit 5 Klonmitgliedern anstelle von 6 wie in dieser aktuellen Studie abgeleitet wurden, entsprechen die Intermediate I5, I3 und I2 sehr genau IA4, IA2 bzw. IA1 in Bonsignori et al.20.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Kryo-EM-Rekonstruktionen und Atommodelle, die während dieser Studie erstellt wurden, sind bei wwPDB und EMBD (www.rcsb.org; http://emsearch.rutgers.edu) unter den folgenden Zugangscodes verfügbar: Kryo-EM-Rekonstruktionen und Atommodelle, die während dieser Studie erstellt wurden Die Studie ist unter wwPDB und EMBD (www.rcsb.org; http://emsearch.rutgers.edu) unter den folgenden Zugangscodes verfügbar: EMD-IDs: EMD-40282, EMD-40283, EMD-40285, EMD-40286, EMD -40287, EMD-40288, EMD-40291, EMD-40290, EMD-40289, EMD-40284, EMD-40280, EMD-40280, EMD-40278, EMD-40277, EMD-40275, EMD-40281, EMD-40279 , EMD-40274, EMD-40273 und PDB-IDs: 8SAW, 8SAX, 8SAZ, 8SB0, 8SB1, 8SB2, 8SB5, 8SB4, 8SB3, 8SAY, 8SAU, 8SAU, 8SAS, 8SAR, 8SAQ, 8SAV, 8SAT, 8SAN, 8SAL.

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Referenzen herunterladen

Kryo-EM-Daten wurden am Duke Krios an der Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF) gesammelt, einem Mitglied des North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), das von der National Science Foundation unterstützt wird (Auszeichnungsnummer ECCS-2025064). ) als Teil der National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI) und am National Center for Cryo-EM Access and Training (NCCAT) und am Simons Electron Microscopy Center am New York Structural Biology Center, unterstützt vom NIH Common Fund Transformative Programm für hochauflösende Kryo-Elektronenmikroskopie (U24 GM129539) und durch Zuschüsse der Simons Foundation (SF349247) und des Staates New York. Diese Studie nutzte die Rechenressourcen von Duke Research Computing (http://rc.duke.edu; NIH 1S10OD018164-01) an der Duke University. Wir danken Advaiti Kane und Parth Patel für die Antigenitätsanalyse von Trimeren. Finanzierung: Dieses Projekt wurde von NIH, NIAID, Division of AIDS Consortia for HIV/AIDS Vaccine Development (CHAVD) Grant UM1AI144371 (BFH), R01AI145687 (PA), NIAID Center for Structural Biology U54AI170752 (PA), NIGMS Grant R01GM141223 (AB) unterstützt ) und Translating Duke Health Initiative (PA und RCH).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Rory Henderson, Ye Zhou.

Abteilung für Medizin und Immunologie, Duke University School of Medicine, Durham, NC, USA

Rory Henderson, Kevin Wiehe, S. Munir Alam und Barton F. Haynes

Duke Human Vaccine Institute, Duke University School of Medicine, Durham, NC, USA

Rory Henderson, Victoria Stalls, Kevin Wiehe, Kevin O. Saunders, Kara Anasti, Maggie Barr, Robert Parks, S. Munir Alam, Barton F. Haynes und Priyamvada Acharya

Institut für Informatik, Duke University, Durham, NC, USA

Ye Zhou und Alberto Bartesaghi

Abteilung für Chirurgie, Duke University School of Medicine, Durham, NC, USA

Kevin O. Saunders und Priyamvada Acharya

Theoretische Biologie und Biophysik, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, USA

Kshitij Wagh & Bette Korber

New Mexico Consortium, Los Alamos, NM, USA

Kshitij Wagh & Bette Korber

Abteilung für Pathologie, Duke University School of Medicine, Durham, NC, USA

S. Munir Alam

Abteilung für Biochemie, Duke University School of Medicine, Durham, NC, USA

Alberto Bartesaghi und Priyamvada Acharya

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, Duke University, Durham, NC, USA

Alberto Bartesaghi

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RH, AB und PA leiteten die Studie; RH, YZ, VS und PA bestimmten und analysierten Kryo-EM-Strukturen; VS exprimierte und gereinigte Proteine; KOS überwachte die Expression und Reinigung von Proteinen; Ks.W. und BK führte Neutralisierungssignaturen durch und analysierte sie; KA führte SPR-Assays durch; SMA überwachte SPR-Assays; MB und RP führten ELISA-Tests durch. RH hat das Manuskript mit Hilfe aller Autoren geschrieben und bearbeitet. BFH und PA haben die Studie konzipiert, herausgegeben und finanziert. PA überwachte die Studie und überprüfte alle Daten.

Korrespondenz mit Rory Henderson, Barton F. Haynes, Albert Bartesaghi oder Priyamvada Acharya.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: Ein Patentantrag für HIV-1-Hüllenmodifikationen auf der Grundlage dieser Studie wurde von der Duke University eingereicht. Aufgrund dieser Einreichung bestehen keine Beschränkungen für die wissenschaftliche Nutzung.

Nature Communications dankt Xueling Wu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Henderson, R., Zhou, Y., Stalls, V. et al. Strukturelle Grundlage für die Breitenentwicklung in der klonalen Abstammungslinie des HIV-1-V3-Glykans, das auf den DH270-Antikörper abzielt. Nat Commun 14, 2782 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

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Eingegangen: 10. August 2022

Angenommen: 14. April 2023

Veröffentlicht: 15. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

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