Ein Impfstoffkandidat gegen Untereinheiten induziert bei Mäusen eine schützende Immunität gegen Mycobacterium avium, Unterart Paratuberculosis

npj Vaccines Band 8, Artikelnummer: 72 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mycobacterium avium, Unterart paratuberculosis (MAP), verursacht Paratuberkulose (PTB), eine granulomatöse Enteritis bei Wiederkäuern, die die gesunde Entwicklung der Milchindustrie und die Sicherheit der öffentlichen Gesundheit weltweit gefährdet. Da die kommerziellen inaktivierten Impfstoffe keinen vollständigen Schutz bieten und die Diagnose von Rindertuberkulose beeinträchtigen, haben wir vier Fusionsproteine ​​getestet, nämlich 66NC, 66CN, 90NC und 90CN, die mit MAP3527, Ag85B und Hsp70 von MAP in verschiedenen Tandemkombinationen konstruiert wurden. Bemerkenswerterweise induzierte 66NC, das ein 66-kDa-Fusionsprotein kodiert, das in linearer Reihenfolge MAP3527N40–232, Ag85B41–330 und MAP3527C231–361 kombiniert, eine starke und spezifische IFN-γ-Reaktion. Die Immunisierung von C57BL/6-Mäusen mit dem 66NC-Fusionsprotein, formuliert in Montanide ISA 61 VG-Adjuvans, erzeugte robuste Immunantworten vom Typ Th1, Th2 und Th17 sowie starke Antikörperantworten. Der 66NC-Impfstoff schützte C57BL/6-Mäuse vor einer virulenten MAP K-10-Infektion. Dies führte zu einer Verringerung der Bakterienbelastung und einer Verbesserung pathologischer Schäden in Leber und Darm sowie zu einer Verringerung des Körpergewichtsverlusts; Es wurde auch ein deutlich besserer Schutz als mit dem berichteten 74-F-Impfstoff induziert. Darüber hinaus korrelierte die Wirksamkeit des Impfstoffs mit den Spiegeln der IFN-γ-, TNF-α- und IL-17A-sekretierenden antigenspezifischen CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten sowie mit den Serum-IFN-γ- und TNF-α-Spiegeln nach der Impfung. Diese Ergebnisse zeigen, dass das rekombinante Protein 66NC ein effizienter Kandidat für die Weiterentwicklung zu einem Schutzimpfstoff im Hinblick auf die Induktion eines spezifischen Schutzes gegen MAP ist.

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) verursacht Paratuberkulose (PTB), allgemein als Johne-Krankheit bezeichnet, eine langfristige granulomatöse Entzündung des Darms sowohl von Haus- als auch Wildwiederkäuern. Zu den klinischen Symptomen, die mit fortschreitender Erkrankung einhergehen, gehören Gewichtsverlust, schwerer Durchfall sowie eine Verschlechterung der Milchleistung und des Körperzustands1. PTB weist eine weltweite Verbreitung und hohe Inzidenz auf und gefährdet die nachhaltige und gesunde Entwicklung der Milchindustrie2,3. Es wird geschätzt, dass ein Großteil der Milchviehherden in den USA, etwa 90 %, mit MAP4 infiziert sind, was in den Vereinigten Staaten zu einem jährlichen wirtschaftlichen Verlust von etwa 250 Millionen Dollar führt3. Darüber hinaus wurde MAP in Säuglingsnahrungspulver und pasteurisierter Milch im Einzelhandel nachgewiesen5,6, und der Erreger wurde bei zahlreichen menschlichen Krankheiten wie Morbus Crohn, Typ-I-Diabetes und Hashimoto-Thyreoiditis7,8,9 gefunden, was eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit weltweit darstellt sozioökonomische Sicherheit.

Trotz der Schwere der PTB bei Wiederkäuern wurde kein wirksamer Impfstoff entwickelt. Drei zuvor verwendete Impfstoffe (Mycopar, Silirum und Gudair) sind alle inaktivierte Ganzzell-MAP, formuliert in Ölemulsionen. Diese Impfstoffe bieten jedoch keinen vollständigen Schutz1 und verursachen lokale Granulome und Abszessbildung an der Injektionsstelle. Das wahrscheinlich größte Hindernis ist die Beeinträchtigung eines diagnostischen Tests, der regelmäßig für Rindertuberkulose und PTB eingesetzt wird1,10. Für jedes wirksame PTB-Kontrollprogramm ist die Reduzierung der fäkalen Ausscheidung von MAP der wichtigste Faktor. Es wurde jedoch festgestellt, dass inaktivierte Impfstoffe nur eine minimale Verringerung der Stuhlausscheidung bewirken11,12. Daher arbeiteten Forscher in den Vereinigten Staaten im Rahmen des Johne's Disease Integrated Program zusammen und nutzten einen Gen-Knockout-Ansatz, um modifizierte Lebendimpfstoffe zu entwickeln, die offenbar die fäkale Ausscheidung von MAP1,10 stoppen. Tatsächlich bieten attenuierte MAP-Lebendimpfstoffe einen besseren Schutz, eine mögliche Beeinträchtigung der Tuberkulose-Diagnosetests ist jedoch nicht ausgeschlossen. Darüber hinaus stellt die Möglichkeit einer unbeabsichtigten Exposition des Menschen gegenüber modifiziertem lebendem MAP ebenfalls ein erhebliches Problem für die öffentliche Gesundheit dar13,14.

Daher besteht ein dringender Bedarf an innovativen und wirksamen Impfstoffen gegen PTB, die die Tuberkulosediagnostik bei Rindern nicht beeinträchtigen. Um diese Probleme anzugehen, erforschen Forscher eine Reihe von Lösungen, beispielsweise Subunit-Impfstoffe und DNA-basierte Impfstoffe. Das MAP-Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist ein immundominantes Antigen15, und die rekombinante MAP-Hsp70-Impfung reduziert bei Kälbern über einen langen Zeitraum die Ausscheidung von Bakterien im Kot16. Eine Studie hat ergeben, dass der Hsp70-Impfstoff die Erkennung von Tuberkulose nicht beeinträchtigt und mit Hsp70 geimpfte Tiere leicht von mit MAP17 infizierten Tieren zu unterscheiden sind. Mit MAP infizierte Rinder und Mäuse lösen eine schnelle und starke T-Zell-Reaktion gegen Kulturfiltratproteine ​​im Allgemeinen und Ag85B-Proteine ​​im Besonderen aus18. Rekombinantes MAP Ag85B, emulgiert in Ribi-Adjuvans, induzierte sowohl eine Immunantwort vom Th1- als auch vom Th2-Typ19. Das Ag85B-Antigen von MAP wurde in transgener Luzerne exprimiert und löste bei Mäusen eine langanhaltende Immunität aus20. Ein Fusionsprotein 74 F, bestehend aus MAP3527 und MAP1519, gemischt mit dem MPL-Adjuvans und einem weiteren Fusionsproteinpartikel-Impfstoff, der die MAP-Antigene Ag85A-SOD-Ag85B-74F enthielt, schützte Mäuse wirksam vor einer MAP-Infektion21,22. Darüber hinaus löste ein abgeschwächter Salmonellenstamm, der die Gene SopE104-Ag85A-SOD-Ag85B und SopE104-74F trug, eine robuste und anhaltende Th1-Immunantwort aus, die durch die Produktion von IFN-γ gekennzeichnet war und Mäusen Schutz vor MAP-Herausforderung bot23. Um Untereinheiten-Impfstoffe gegen PTB zu entwickeln, ist es wichtig, mykobakterielle Antigene zu identifizieren, die vorzugsweise CD4+- und CD8+-T-Zellen zur Proliferation und Sekretion von IFN-γ1,21,24 aktivieren. Frühere Studien haben drei MAP-Antigene (MAP3527, Ag85B und Hsp70) unter kontrollierten Infektionsbedingungen bei Schafen, Rindern und Mäusen identifiziert, die sich durch ihre Fähigkeit auszeichnen, T-Zell- und Antikörperreaktionen zu induzieren16,18,21. In dieser Studie konstruierten wir vier Fusionsproteine ​​durch Tandemkombination von MAP3527, Ag85B und Hsp70 in verschiedenen Kombinationen, die entsprechend ihrem Molekulargewicht 66NC, 66CN, 90NC und 90CN genannt wurden. Wir haben die immunprotektiven Eigenschaften dieser Fusionsproteine ​​weiter in einem Mausmodell untersucht.

Insbesondere werden Wiederkäuer-Infektionsmodelle häufig für PTB-Impfstudien verwendet24,25. Aufgrund der langen Inkubationszeit der Krankheit bei Wiederkäuern und der Kosten für die Durchführung von Experimenten wurden jedoch Nichtwiederkäuer-Versuchstiere als Ersatz für Wiederkäuer entwickelt. C57BL/6-Mäuse werden häufig als Modelle zur Untersuchung von MAP-Infektionen und zur Impfstoffentwicklung verwendet21,26,27. Diese Studie konzentriert sich auf die Immunogenität und Schutzwirkung des mit dem Adjuvans Montanide ISA 61 VG formulierten Fusionsproteins 66NC, das in einem Mausmodell untersucht und mit dem Polyprotein 74 F verglichen wurde.

Gezeigt wird eine schematische Darstellung von 66NC, 66CN, 90NC und 90CN mit der Organisation und den Restriktionsenzymstellen (EcoR I und Hind III), die zum Aufbau des Fusionsproteins verwendet wurden, sowie Daten zur Proteinreinigung unter Verwendung eines N-terminalen Sechs-Histidin-Tags in Abb. 1a. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von vier Fusionsproteinen sind in der Ergänzungssequenz 1 verfügbar. Die ORF-Längen von 66NC, 66CN, 90NC und 90CN betragen 1902 bp, 1902 bp, 2547 bp und 2547 bp und kodieren für 653 aa, 653 aa, 868 aa bzw. 838 aa mit vorhergesagten Molekularmassen von ~66 kDa, ~66 kDa, ~90 kDa bzw. ~90 kDa. Das exprimierte rekombinante Protein in der E.-Spirale wurde durch Ni-Säulen-Affinitätschromatographie gereinigt (Abb. 1b – d). Die Reinigung des Polyproteins 74 F wurde gemäß früheren Berichten21 durchgeführt und mittels SDS-PAGE analysiert (Abb. 1e).

a Schematische Darstellung der Konstrukte 66NC, 66CN, 90NC und 90CN. b Reinigung eines rekombinanten 90CN-Fusionsproteins. Linie M, Molekulargewichtsmarker des Proteins; Zeile 1, 90CN-Protein nach Renaturierung; Leitung 2, Durchfluss vom Harz; Zeile 3, proteingebundenes Harz vor dem Waschen; Zeile 4, proteingebundenes Harz nach dem Waschen; Zeile 5: gereinigtes 90CN-Protein, eluiert mit 500 mM Imidazol. c Reinigung eines rekombinanten 90NC-Fusionsproteins. Linie M, Molekulargewichtsmarker des Proteins; Zeile 1, 90NC-Protein nach Renaturierung; Leitung 2, Durchfluss vom Harz; Zeile 3, proteingebundenes Harz vor dem Waschen; Zeile 4, proteingebundenes Harz nach dem Waschen; Zeile 5: gereinigtes 90NC-Protein, eluiert mit 500 mM Imidazol. d Reinigung des rekombinanten 66CN- und 66NC-Fusionsproteins. Linie M, Molekulargewichtsmarker des Proteins; Leitung 1, Durchfluss vom Harz; Zeile 2, proteingebundenes Harz vor dem Waschen; Zeile 3, proteingebundenes Harz nach dem Waschen; Zeile 4 und 5: gereinigtes 66CN-Protein, eluiert mit 500 mM bzw. 1 M Imidazol; Zeile 6, proteingebundenes Harz nach Elution; Linie 7, Durchfluss vom Harz; Zeile 8, proteingebundenes Harz vor dem Waschen; Zeile 9, proteingebundenes Harz nach dem Waschen; Zeile 10 und 11: gereinigtes 66NC-Protein, eluiert mit 500 mM bzw. 1 M Imidazol. e Reinigung eines rekombinanten 74 F-Fusionsproteins. Linie M, Molekulargewichtsmarker des Proteins; Leitung 1, Durchfluss vom Harz; Zeile 2, proteingebundenes Harz vor dem Waschen; Zeile 3, proteingebundenes Harz nach dem Waschen; Zeile 4 und 5: gereinigtes 74 F-Protein, eluiert mit 200 mM bzw. 500 mM Imidazol. Alle Gele stammen aus demselben Experiment und wurden parallel verarbeitet.

IFN-γ ist entscheidend für die Bekämpfung intrazellulärer Krankheitserreger wie Mykobakterien28,29. Um die optimalen Adjuvanzien und Immunisierungswege zu ermitteln, immunisierten wir Mäuse subkutan oder intramuskulär mit 66NC-Fusionsprotein, emulgiert mit Montanide ISA 61 VG, Montanide GEL 02 PR oder Montanide ISA 206 VG. Drei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden Splenozyten der immunisierten Mäuse für den IFN-γ-ELISpot-Assay gesammelt (Abb. 2a). Die subkutane Immunisierung von Mäusen mit 66NC, formuliert in Montanide ISA 61 VG-Adjuvans, führte im Vergleich zu denen der anderen 11 Gruppen nach In-vitro-Stimulation von Milzlymphozyten-Kokulturen mit 66NC-Fusionsprotein zur Erzeugung der stärksten IFN-γ-Reaktion (Abb. 2b). , C). Um die optimalen Immunogene zu testen, immunisierten wir Mäuse subkutan mit dem Adjuvans Montanide ISA 61 VG, gemischt mit 66NC-, 66CN-, 90NC- oder 90CN-Fusionsprotein. Die Immunisierung von Mäusen mit 66NC stimulierte die stärkste Produktion der IFN-γ-Reaktion gegen das 66NC-Fusionsprotein im Vergleich zu mit 66CN, 90NC und 90CN immunisierten Mäusen (Abb. 2d, e). Die obigen Ergebnisse zeigen, dass der beste Weg der Immunisierung, des Adjuvans und des Immunogens eine subkutane Injektion von Montanide ISA 61 VG-Adjuvans bzw. 66NC-Fusionsprotein war, die bei C57BL/6-Mäusen eine starke Antigen-spezifische IFN-γ-Reaktion induzierte.

a Schematische Darstellung des Impfzeitplans. b, c Der IFN-γ-ELISpot-Assay wurde verwendet, um die antigenspezifische IFN-γ-Expression in Milzlymphozyten von Mäusen zu bestimmen, die intramuskulär (IM) und subkutan (SC) mit 66NC-Fusionsprotein, formuliert in verschiedenen Adjuvantien Montanide ISA 206 VG (206 VG), immunisiert wurden ), Montanide ISA 61 VG (61 VG) und Montanide GEL 02 PR (GEL) getestet und mit dem angegebenen Antigen stimuliert, wobei das Adjuvans allein als Negativkontrolle diente. b Repräsentative Bilder des IFN-γ ELISpot-Assays (repräsentatives Experiment mit mindestens drei unabhängigen Replikaten). c Quantifizierung des IFN-γ ELISpot-Assays. d, e Der IFN-γ-ELISpot-Assay wurde verwendet, um die antigenspezifische IFN-γ-Expression in Milzlymphozyten von Mäusen zu bestimmen, die subkutan (SC) mit Fusionsprotein (66NC, 66NC, 90NC und 90CN), formuliert in Montanide ISA 61 VG-Adjuvans, immunisiert wurden und mit dem angegebenen Antigen stimuliert, wobei das Adjuvans allein als Negativkontrolle diente. d Bilder des IFN-γ-ELISpot-Assays (repräsentativ für ein Experiment mit mindestens drei unabhängigen Replikaten). e Quantifizierung des IFN-γ ELISpot-Assays. c, e Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurde eine einfache ANOVA verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. ***P < 0,001.

Mäuse wurden zweimal im Abstand von zwei Wochen mit 50 μg 66NC, gemischt mit 61VG-Adjuvans, über den subkutanen Weg immunisiert, und 74-F-Polyprotein wurde als Untereinheit-Impfstoffkontrolle verwendet. Drei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden sechs Mäuse aus jeder Gruppe getötet und der Anti-66NC-Antikörper, die Zytokinsekretion und die T-Zell-Reaktion bewertet (Abb. 3a). Bezüglich der Antikörperreaktionen zeigten mit 66NC immunisierte Mäuse robuste IgG1- und IgG2a-Reaktionen gegen das 66NC-Fusionsprotein und die Antikörperspiegel der mit 66NC immunisierten Mäuse waren signifikant höher als die der mit 74 F immunisierten Mäuse (Abb. 3b). Die Kontrollgruppen, die nur Adjuvans erhielten, zeigten keine spezifischen Reaktionen auf 66NC.

a Schematische Darstellung des Impfzeitplans. C57BL/6-Mäusen wurden zwei Mal (im Abstand von drei Wochen) 50 μg 66NC-Fusionsprotein, formuliert in Montanide ISA 61 VG-Adjuvans, subkutan injiziert. Zu den Kontrollgruppen gehören Mäuse, die mit Montanide ISA 61 VG-Adjuvans allein als Negativkontrolle oder mit 74 F gemischtem MPL-Adjuvans als Untereinheit-Impfstoffkontrolle immunisiert wurden. Drei Wochen nach der Auffrischimpfung wurde den Mäusen Blut entnommen und sie wurden getötet. b Antigenspezifische IgG1- und IgG2a-Isotypen wurden mittels ELISA gemessen. c Bilder des IFN-γ- und IL-4-ELISpot-Assays (repräsentativ für ein Experiment mit mindestens fünf unabhängigen Replikaten). d, e Quantifizierung des IFN-γ- und IL-4-ELISpot-Assays. f Der Prozentsatz der Zytokin-positiven (%Cyt+) Antigen-spezifischen T-Lymphozyten wurde durch intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) in CD4+ und CD8+ nach Stimulation von Milz-T-Lymphozyten mit dem angegebenen Antigen quantifiziert. g Die Serumzytokinspiegel von IFN-γ, TNF-α und IL-17A wurden mittels ELISA gemessen. d–g Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurde eine einfache ANOVA verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. **P < 0,01, ***P < 0,001.

Th1-Zellen produzieren Zytokine wie IFN-γ, TNF-α und IL-2, wobei IFN-γ das Zytokin ist, das die Abstammungslinie charakterisiert30. Im Vergleich zu Th1-Zellen erzeugen Th2-Zellen IL-4, IL-5 und IL-13, und IL-4 ist das primäre Zytokin, das zur Umwandlung naiver T-Zellen in Th2-Zellen beiträgt30. Die Th1- und Th2-Immunantworten wurden mittels IFN-γ- und IL-4-ELISpot-Assay bewertet. Die 66NC-Impfung induzierte eine höhere relative Anzahl von IFN-γ- und IL-4-exprimierenden Milzlymphozyten als die 74-F-Impfung oder nur die adjuvante Impfung (Abb. 3c – e).

Anschließend haben wir die Antigen-spezifischen T-Lymphozyten-Reaktionen in der Milz durch ICS-Analysen ausgewertet. In der Milz von 66NC-geimpften Mäusen wurden im Vergleich zu 74F-geimpften Mäusen höhere IFN-γ-, TNF-α- und IL-17A-sekretierende CD4+-T- und CD8+-T-Zellreaktionen beobachtet (Abb. 3f). Zusätzlich wurden die Spiegel von IFN-γ, TNF-α und IL-17A in den Seren mittels ELISA bestimmt. Die Spiegel dieser drei Zytokine waren bei Mäusen, die mit 66NC immunisiert wurden, höher als bei Mäusen, die mit 74 F immunisiert wurden oder denen nur Adjuvans verabreicht wurde (Abb. 3g). Diese Daten legen nahe, dass 66NC-geimpfte Mäuse Immunantworten vom Typ Th1, Th2 und Th17 sowie starke Antikörperreaktionen zeigten.

In der sechsten Woche wurden geimpfte Mäuse intraperitoneal mit 109 KBE MAP K-10 provoziert und in den Wochen 2, 4, 8 und 12 nach der Provokation eingeschläfert, um die Schutzwirkung zu bewerten (Abb. 4a). Im klinischen Stadium der PTB gehören zu den Symptomen anhaltender Durchfall, Gewichtsverlust und fortschreitende Abmagerung31. Während des Versuchszeitraums überwachten wir das Körpergewicht der geimpften Mäuse 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der Exposition. Die Gewichtszunahme der mit 66NC geimpften Mäuse war vergleichbar mit der von Blindmäusen und deutlich höher als bei den mit 74 F oder nur mit Adjuvans geimpften Mäusen in der zweiten Woche nach der Belastung. Diese Unterschiede blieben in den Wochen 4, 8 und 12 bestehen (Abb. 4b). Es wird vermutet, dass humorale Immunität im Kampf gegen MAP32 von Vorteil sein könnte. Die Antikörperspiegel in den Seren in den Wochen 2–18, gemessen in Abständen von 2 Wochen nach der Immunisierung, wurden mittels ELISA bestimmt. Die IgG- und IgM-Spiegel der mit 66NC immunisierten Mäuse waren höher als die der mit 74 F oder Adjuvans allein immunisierten Mäuse, und der IgM-Antikörper blieb bis zu 12 Wochen nach der Impfung erhalten (Abb. 4c, d). Bemerkenswerterweise blieb der IgG-Antikörpertiter bis zur 18. Woche auf einem hohen Niveau (Abb. 4c). Die bakterielle Belastung (CFU) wurde in der Leber und im Darm von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Exposition gemessen. In der Leber war die MAP-Belastung bei den mit 66NC geimpften Mäusen im Vergleich zu den mit 74 F oder nur mit Adjuvans geimpften Mäusen 2, 4 und 8 Wochen nach der Belastung signifikant verringert (Abb. 4e). Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden in der Leber geimpfter Mäuse zwei Wochen nach der Exposition unter Verwendung der Ziehl-Neilsen-Färbung beobachtet (Abb. 4g). Mit 66NC geimpfte Mäuse zeigten im Vergleich zu mit 74 F oder nur mit Adjuvans geimpften Mäusen 2 und 4 Wochen nach der MAP K-10-Provokation eine signifikant verringerte MAP-Belastung im Darm (Abb. 4f). Zwölf Wochen nach der Exposition wurden keine Bakterien aus der Leber und acht Wochen und zwölf Wochen nach der Exposition aus dem Darm kultiviert.

a Schematische Darstellung des Zeitplans für Impfung und MAP-Challenge. C57BL/6-Mäusen wurden zwei Mal (im Abstand von drei Wochen) 50 μg 66NC-Fusionsprotein, formuliert in Montanide ISA 61 VG (61 VG)-Adjuvans, subkutan injiziert. Zu den Kontrollgruppen gehören Mäuse, die mit Montanide ISA 61 VG-Adjuvans allein als Negativkontrolle oder mit 74 F gemischtem MPL-Adjuvans als Untereinheit-Impfstoffkontrolle immunisiert wurden. Drei Wochen nach der Auffrischungsimpfung wurden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit MAP K-10 infiziert. b Das Körpergewicht wurde 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der MAP-Exposition gemessen (n = 6 pro Gruppe). Überwachen Sie die IgG- (c) und IgM-Antikörperspiegel (d). Seren wurden gesammelt und 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 Wochen nach der Erstimpfung mittels ELISA auf spezifische Anti-66NC- oder 74 F-Antikörperantwort von IgG und IgM gemessen. Die Quantifizierung der Bakterienbelastung wurde in der Leber (e) und im Darm (f) von Mäusen ausgewertet, denen 2, 4 und 8 Wochen nach der Impfung eine intraperitoneale Injektion mit MAP K-10 verabreicht wurde. g Präsentiert werden repräsentative Bilder der säurefesten Ziehl-Neelsen-Färbung in der Leber geimpfter Mäuse, zwei Wochen nach der MAP-Exposition (Maßstabsbalken, 100 μm (oben) und 10 μm (unten)). Die unteren Bilder werden gegenüber den umrissenen Bereichen der oberen Bilder vergrößert. b, e, f Die Daten zeigen kumulative Ergebnisse von mindestens drei bis sechs unabhängigen Replikaten. Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurden Mittelwert ± SEM und Zwei-Wege-ANOVA verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. ns, nicht signifikant; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.

Makropathologie und Histopathologie wurden an Leber- und Darmproben durchgeführt, die nach einer Autopsie von Mäusen 2 Wochen nach der Exposition entnommen wurden. Bei Mäusen, die nur mit 74 F und Adjuvans immunisiert worden waren, wurden zahlreiche Granulome auf der Leberoberfläche beobachtet. Im Gegensatz dazu waren die Granulome bei mit 66NC immunisierten Mäusen weniger und kleiner (Abb. 5a, b, schwarzer Pfeil). Darüber hinaus wurden bei Mäusen, die nur mit 74 F und Adjuvans immunisiert wurden, sichtbare Makrogranulome im Darm beobachtet, während bei 66NC-geimpften Mäusen keine sichtbare Pathologie auftrat (Abb. 5c, d, schwarzer Pfeil). Was die Histopathologie betrifft, so zeigten die Leberproben von Mäusen, denen nur Adjuvans verabreicht wurde, multiple Mikrogranulome (schwarzer Pfeil), und fokale sichtbare große Bereiche der Nekrose führten zur Bildung von Makrogranulomen (grüner Pfeil).

Um die Makropathologie zu bewerten, wurden Leber und Darm von Mäusen fotografiert, die zwei Wochen nach der Impfung einer intraperitonealen Injektion mit MAP K-10 ausgesetzt waren. Ein Bild stellt ein Experiment mit mindestens fünf unabhängigen Replikaten dar. a Makropathologische Veränderungen in der Leber. Montanide ISA 61 VG (61 VG): zahlreiche Makrogranulome (schwarzer Pfeil), 66NC: wenige Mikrogranulome (schwarzer Pfeil), 74 F: zahlreiche Makrogranulome (schwarzer Pfeil). b Leber-Makropathologie-Score. c Makropathologische Veränderungen im Darm. Montanide ISA 61 VG (61 VG): Makrogranulome (schwarzer Pfeil), 66NC: keine sichtbare Pathologie, 74 F: Makrogranulome (schwarzer Pfeil). d Makropathologie-Score des Darms. Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurden b, d Mittelwert ± SEM und eine einfache ANOVA verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. ns, nicht signifikant; *P < 0,05; ***P < 0,001.

Im Gegensatz dazu wies die Leber der 66NC-geimpften Mäuse nur multiple Mikrogranulome auf (schwarzer Pfeil; Abb. 6a, b). Darüber hinaus wurden bei den mit 74 F geimpften Mäusen sichtbare Makrogranulome der Serosa (grüner Pfeil) und mehrere Mikrogranulome im Parenchym (schwarzer Pfeil) beobachtet. Ebenso wies der Darm von nur mit Adjuvans oder 74 F geimpften Mäusen ein Makrogranulom auf der serösen Oberfläche auf (grüner Pfeil). Darüber hinaus infiltrieren viele entzündliche Zellen die Muskularis oder die Lamina propria (blauer Pfeil). Im Gegensatz dazu war der Darm der 66NC-geimpften Mäuse ohne Pathologien (Abb. 6c, d). Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass das in Montanide ISA 61 VG-Adjuvans formulierte 66NC-Fusionsprotein zum verbesserten Schutz von C57BL/6-Mäusen gegen MAP K-10 beitrug und besser ist als das in MPL-Adjuvans gemischte 74 F-Fusionsprotein.

Die Histopathologie wurde in den mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Leber- und Darmschnitten von Mäusen untersucht, die 2 Wochen nach der Impfung einer intraperitonealen Injektion mit MAP K-10 ausgesetzt waren. Ein Bild stellt ein Experiment mit mindestens fünf unabhängigen Replikaten dar. a Histopathologische Veränderungen in der Leber (Maßstabsbalken, 200 μm (oben) und 50 μm (unten)). Montanide ISA 61 VG (61 VG): Makrogranulome (grüner Pfeil) und multiple Mikrogranulome (schwarzer Pfeil), 66NC: multiple Mikrogranulome (schwarzer Pfeil), 74 F: Makrogranulome (grüner Pfeil) und multiple Mikrogranulome (schwarzer Pfeil) . Die unteren Bilder werden gegenüber den umrissenen Bereichen der oberen Bilder vergrößert. b Leber-Histopathologie-Score. c Histopathologische Veränderungen im Darm (Maßstabsbalken, 200 μm (oben) und 50 μm (unten)). Montanide ISA 61 VG (61 VG): Makrogranulome (grüner Pfeil) und entzündliche Zellinfiltration (blauer Pfeil), 66NC: ohne Pathologien, 74 F: Makrogranulome (grüner Pfeil) und entzündliche Zellinfiltration (blauer Pfeil). Die unteren Bilder werden gegenüber den umrissenen Bereichen der oberen Bilder vergrößert. d Darm-Histopathologie-Score. Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurden b, d Mittelwert ± SEM und eine einfache ANOVA verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. ns, nicht signifikant; *P < 0,05; **P < 0,01.

Um die Korrelation zwischen Zytokinspiegeln und Bakterienlast (CFU) bei Mäusen nach der Immunisierung zu untersuchen, haben wir die Antigen-spezifischen Zytokin-sekretierenden (Cyt+), CD4+- oder CD8+-T-Lymphozyten aus der Milz und den Serumzytokinspiegel geimpfter Mäuse untersucht zwei Wochen nach den MAP K-10-Herausforderungen. Die 66NC-Immunisierung führte zu höheren IFN-γ-, TNF-α- und IL-17A-sezernierenden Antigen-spezifischen CD4+- oder CD8+-T-Zell-Reaktionen in der Milz als die 74-F-Impfung oder Adjuvans allein nach der Belastung (Abb. 7a). und es wurden konsistente Ergebnisse für den IFN-γ- und TNF-α-Spiegel im Serum von Mäusen beobachtet, die gegen MAP K-10 immunisiert waren; Leider wurde IL-17A im Serum nicht nachgewiesen (Abb. 7c). Unter IFN-γ- (P = 0,00033 oder P = 0,029), TNF-α- (P = 0,0039 oder P = 0,005), IL-17A- (P = 0,02 oder P = 0,13) und IFN-γ + TNF- α + IL-17A-(P = 0,00042 oder P = 0,0075) sezernierende Antigen-spezifische CD4+- oder CD8+-T-Zellen in der Milz korrelierten mit einer verringerten Bakterienbelastung in der Leber (Abb. 7b) und dem IFN-γ-Spiegel (P = 0,012), TNF-α (P = 0,00071) und IFN-γ + TNF-α (P = 0,0047) im Serum korrelierten ebenfalls mit einer verringerten Bakterienlast in der Leber (Abb. 7d). Konsistente Ergebnisse wurden auch im Darm beobachtet (ergänzende Abbildung 1), was auf die Bedeutung von IFN-γ, TNF-α und IL-17A für den Schutz vor MAP schließen lässt.

a Prozentsatz der Zytokin-positiven (Cyt+) Milz-CD4+- und CD8+-T-Zellen, gemessen durch intrazelluläre Zytokinfärbung zwei Wochen nach der MAP-Provokation von Mäusen, die mit dem angegebenen Antigen geimpft wurden. b Pearson-Korrelation (R) von Cyt+ CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten mit CFU in der Leber nach der Belastung. c Serumzytokinspiegel von Montanide ISA 61 VG (61 VG) Adjuvans und geimpften Mäusen (66NC und 74 F) wurden 2 Wochen nach der Belastung durch MAP K-10 bewertet. d Pearson-Korrelationen der Zytokinspiegel mit CFU in der Leber nach Belastung durch IFN-γ und TNF-α. Daten repräsentativ für ein Experiment mit mindestens fünf unabhängigen Wiederholungen, Mittelwert ± SEM. Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurde eine einfache ANOVA verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. ns, nicht signifikant; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.

Die Entwicklung von Impfstoffen aus rekombinanten Proteinuntereinheiten, die aus klar definierten Zusammensetzungen bestehen, die durch heterogene Expressionssysteme produziert werden, hat in den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erhalten33,34. Ein Subunit-Impfstoff kann sich im Körper nicht vermehren und gilt daher als sicherer35. Unter dem Gesichtspunkt der Kompatibilität würde ein idealer Subunit-Impfstoff die Krankheitsdiagnose durch aktuelle Tests nicht beeinträchtigen. Es wurde festgestellt, dass mehrere MAP-Proteine ​​bei Versuchstieren einen unterschiedlichen Schutz vor Infektionen bewirken19,36,37. Berichten zufolge eignet sich eine Mischung rekombinanter Antigene besser für die Impfstoffentwicklung. Allerdings könnten die Kosten für die Herstellung und Anwendung eines solchen Impfstoffs für Rinder oder Schafe zu hoch sein. Um dieses Problem anzugehen, werden Fusionsproteine ​​konstruiert und anhand eines Mausmodells auf ihre Fähigkeit getestet, einen Immunschutz gegen MAP zu bieten. Es wurde festgestellt, dass ein Fusionsprotein, 74 F von MAP, mit Monophosphoryl-Lipid A (MPL) und Dimethyloctadecyl-Ammoniumbromid (DDA) als Adjuvans Mäuse bzw. Ziegen schützt21,24. Inspiriert durch den Erfolg dieses Fusionsproteins konstruierten wir vier Fusionsproteine ​​unter Verwendung der Gene map3527, ag85b und hsp 70 von MAP (Abb. 1a). Die Kosten für Veterinärimpfstoffe sind ein wesentliches Thema, und die Verwendung teurer Immunstimulanzien wie DDA und MPL für die großtechnische Produktion von Tierimpfstoffen wäre unerschwinglich. In dieser Studie haben wir vorgeschlagen, Mineralöl-Adjuvans (Montanide ISA 61VG und Montanide ISA 206 VG) und wasserbasiertes Adjuvans (Montanide GEL 02 PR) als Adjuvantien in Untereinheitenimpfstoffen zu verwenden, da sie sowohl spezifische humorale als auch zelluläre Immunantworten induzieren können und dies auch tun weit verbreitet in der Impfstoffforschung bei Rindern, Schafen und Mäusen38,39,40,41. Obwohl sie nicht resorbierbar und stark reizend sind (was Nachteile sind), können ölbasierte Adjuvanzien das Antigen vor einem schnellen Abbau durch Enzyme schützen und die Emulsion erhöht die Antigenpersistenz, um anhaltende Immunantworten auszulösen38.

IFN-γ ist ein wichtiges Zytokin, das bei einer Infektion von Rindern mit MAP42 ausgelöst wird, und Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte Expression von IFN-γ bei mit DNA-Impfstoffen immunisierten Lämmern diese vor einer MAP-Infektion schützen kann37. In der vorliegenden Studie haben wir Mäuse mit den vier Fusionsproteinen (66NC, 66CN, 90NC und 90CN) in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien immunisiert. Mithilfe eines IFN-γ-ELISpot-Screenings haben wir die wirksamste Kombination aus Immunogen (66NC) und Montanide ISA 61VG-Adjuvans identifiziert. Wir beobachteten, dass Mäuse, die mit dem mit 61VG-Adjuvans formulierten 66NC-Fusionsprotein geimpft wurden, eine deutlich höhere Antigen-spezifische IFN-γ-Reaktion aufwiesen als Mäuse, die nur mit Adjuvans oder 74 F-Fusionsprotein immunisiert wurden. Es wird angenommen, dass zellvermittelte Immunantworten am erfolgreichsten sind, wenn es darum geht, intrazelluläre Krankheitserreger, einschließlich Mykobakterien, zu eliminieren und Schutz zu bieten43. Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass ein Impfstoff, der aus mehreren Komponenten besteht und sowohl T- als auch B-Zell-vermittelte Immunantworten induziert, beim Schutz vor Mycobacterium tuberculosis (MTB) H37Rv wirksamer ist als ein Untereinheiten-Impfstoff, der nur die T-Zell-Immunität stimuliert44. Die aktuelle Studie ergab, dass Mäuse, die mit dem 66NC-Fusionsprotein immunisiert wurden, eine ausgeprägtere Antigen-spezifische IL-4-Reaktion und eine stärkere Antikörperreaktion aufwiesen als diejenigen, die mit Adjuvans allein oder 74 F immunisiert wurden. Darüber hinaus förderten Antikörper während einer latenten Tuberkulose-Infektion die phagolysosomale Reifung und Aktivierung des Inflammasoms, was die Abtötung von intrazellulärem MTB45 durch Makrophagen erleichtert. Darüber hinaus war eine starke anfängliche IgG1-Reaktion nach geimpften Schafen entscheidend, um eine MAP-Infektion zu verhindern32. Obwohl eine nach der BCG-Impfung erzeugte Th1-Reaktion nicht immer auf einen Schutz hinweist46, wurde IL-4, ein Th2-Zytokin, mit der Abwehr gegen Mykobakterien in Verbindung gebracht47. Insgesamt wurde beobachtet, dass das 66NC-Fusionsprotein antigenspezifische zellvermittelte und humorale Immunantworten hervorruft, die ein wesentlicher Faktor beim Schutz vor MAP sein könnten.

In den Anfangsstadien einer MAP-Infektion stimulieren CD4+-Lymphozyten IFN-γ, aktivieren Makrophagen auf klassische Weise (M1), setzen proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1β und IL-6 frei und verstärken die mikrobizide Aktivität48, 49,50. Während einer MAP-Infektion spielen CD8+-zytotoxische T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von intrazellulärem MAP1. Wir fanden heraus, dass antigenspezifische CD4+- oder CD8+-T-Zellantworten, die IFN-γ und TNF-α sezernieren, mit dem Schutz bei C57BL/6-Mäusen verbunden waren, nachdem sie zwei Wochen lang immunisiert und herausgefordert wurden. Darüber hinaus wurden ähnliche Ergebnisse beim Spiegel von IFN-γ und TNF-α im Serum von gegen MAP immunisierten Mäusen beobachtet. Wir beobachteten auch, dass IL-17A-sekretierende antigenspezifische CD4+- oder CD8+-T-Zellreaktionen nach der Impfung mit dem Immunschutz bei C57BL/6-Mäusen zwei Wochen nach der Exposition korrelierten. Es gibt Hinweise darauf, dass die IL-17-Sekretion, die teilweise Gamma-Delta-T-Zellen (γδT) und angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 3 (ILC3) zugeschrieben werden kann, die Phagozytenkapazität und die Antigenpräsentation verbessern kann51,52. Nach der Impfung mit einem abgeschwächten MTB-ΔLprG-Impfstoff war ein Anstieg der IL-17A-Spiegel im Serum mit einer Verringerung der Bakterienlast in der Lunge nach der MTB-Exposition verbunden53. Die Analyse des inaktivierten Impfstoffs Silirum ergab, dass es keinen statistisch signifikanten Unterschied in den Transkriptionsniveaus von IL-17A zwischen geimpften und nicht geimpften Ziegen durch von Monozyten abgeleitete Makrophagen gab54. Unsere Studie ergab, dass das Serum von Mäusen, die mit 66NC immunisiert wurden, im Vergleich zu den nicht immunisierten und 74 F-immunisierten Gruppen einen signifikant höheren IL-17A-Spiegel aufwies. Obwohl IL-17A zwei Wochen nach der Exposition nicht im Serum nachgewiesen werden konnte, konnten immer noch antigenspezifische CD4+- oder CD8+-T-Zellreaktionen beobachtet werden, die IL-17A sezernieren. Die Haupterklärung hierfür ist, dass beobachtet wurde, dass IL-17 in PBMCs sowohl von Ziegen, die mit MAP28 infiziert waren, als auch von Rindern mit einer subklinischen Infektion von MAP55 reduziert war. Darüber hinaus kann die Sekretion des IL-17A-Zytokins bei immunisierten Mäusen gegen eine MAP-Infektion abnehmen, die Konzentrationssensitivität des ELISA-Assays ist jedoch begrenzt.

Wenn keine klinischen Symptome vorliegen, ist der Goldstandard für die Bewertung der Schutzwirkung von MAP-Impfungen die Pathologie und Bakterienbelastung des Gewebes56,57. Um die Schutzwirkung von 66NC zu bewerten, wählten wir daher Leber und Darm als Beurteilungsorgane, da sich diese in früheren Studien als zuverlässige Indikatoren für den Infektionsstatus von Mäusen nach der MAP-Exposition erwiesen hatten26,58. Zwei Wochen nach der Belastung wurde eine Verringerung der KBE-Anzahl sowohl in der Leber als auch im Darm beobachtet, was auf die Eliminierung von MAP schließen lässt. Darüber hinaus reduzierte das 66NC-Fusionsprotein erfolgreich den pathologischen Schaden und die Menge säurefester Bakterien in der Leber geimpfter Tiere. Wiederkäuer, die an PTB leiden, leiden unter Durchfall und einer drastischen Verringerung des Körpergewichts59,60. Wir haben das Körpergewicht der 66NC-geimpften Mäuse nach der Herausforderung gemessen. Das Körpergewicht der mit 66NC immunisierten Mäuse blieb mit dem der Blindmäuse vergleichbar, im Gegensatz dazu nahm das Körpergewicht der mit 74 F und der Adjuvansgruppe immunisierten Mäuse unterschiedlich stark ab. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Immunisierung mit 66NC Mäuse deutlich wirksamer vor einer MAP-Infektion schützt als der 74-F-Impfstoff, was durch die deutlich verringerte MAP-Belastung in den Organen, eine verbesserte Leber- und Darmpathologie und die Aufrechterhaltung des Körpergewichts belegt wird.

Zusammenfassend führte die Impfung mit dem 66NC-Fusionsprotein zu einer Bakterienkontrolle, einer Linderung pathologischer Schäden in Leber und Darm und einem verringerten Körpergewichtsverlust nach der MAP-K-10-Exposition bei C57BL/6. Es wurde eine Korrelation zwischen dem Schutz und der Sekretion von IFN-γ, TNF-α und IL-17A durch antigenspezifische CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten in der Milz von Mäusen nach der Belastung beobachtet. Darüber hinaus wurden die Serum-IFN-γ- und TNF-α-Spiegel nach der Immunisierung mit der Schutzwirkung in Verbindung gebracht. Darüber hinaus zeigen mit 66NC immunisierte Mäuse eine größere Schutzwirkung gegen MAP K-10 als solche, die mit 74 F immunisiert wurden. Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften der Antigene im Fusionsprotein-Impfstoff ist eine Beeinträchtigung des Rindertuberkulose-Hauttests bei Rindern oder Schafen unwahrscheinlich. Weitere Untersuchungen an Tierarten wie Rindern oder Schafen sind erforderlich, um festzustellen, ob der Impfstoff gegen die Fusionsprotein-66NC-Untereinheit vor PTB schützen kann, ohne Reaktionen auf den Rindertuberkulose-Hauttest hervorzurufen.

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis K-10 wurde in Middlebrook 7H9-Medium (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) oder Middlebrook 7H10-Medium (BD Biosciences) gezüchtet, ergänzt mit 0,05 % Tween 80 (Amresco, Solon, OH, USA), 0,2 % Glycerin (Sigma-Aldrich, Shanghai, China), 10 % Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase (OADC, BD Biosciences) und 2 mg/L Mycobactin J (Allied Monitor, Fayette, MO, USA) bei 37 °C. Sechs Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse wurden von Liaoning Changsheng Biotechnology Co. Ltd (Liaoning, China) gekauft. Alle Tierversuche waren darauf ausgelegt, die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren, und es wurden Anstrengungen unternommen, sowohl Stress als auch Schmerzen zu minimieren. Diese Studie wurde von der Tierethikkommission des Harbin Veterinary Research Institute, China, genehmigt (Genehmigungsnummer der Ethikkommission HVRI-IACUC-200723-01).

66NC wurde durch die kontinuierliche Verbindung zusammen mit den offenen Leserahmen (ORFs) des ~18,9 kDa N-terminalen Teils von MAP3527 (Reste 40–232, 193 aa) bis zum ~30,8 kDa von Ag85B ohne das Signalpeptid (Reste) erzeugt 41–330, 290 aa, mit weggelassenem Stoppcodon), gefolgt am C-Terminus mit dem ~13,0 kDa C-terminalen Fragment (Reste 231–361, 131 aa, mit weggelassenem Stoppcodon) von MAP3527. Darüber hinaus umfasst 66NC einen einzelnen ORF, der in der linearen Reihenfolge MAP3527N40–232-Ag85B41-330–MAP3527C231–361 organisiert ist; 66CN wurde durch die Tandem-ORFs des MAP3527C231–361 zum Ag85B erzeugt, gefolgt vom MAP3527N40–232, vom MA3527C231–361-Ag85B41–330-MAP3527N40–232 ORF.

90NC, das den ORF voller Länge von Hsp70 (ohne Stoppcodon) anstelle von Ag85b enthält, wird vom ORF MA3527N40–232-Hsp70-MAP3527C231–361 kodiert. Ebenso enthält 90CN das Hsp70 anstelle von Ag85b, es wird jedoch vom ORF MA3527C231–361-Hsp70-MAP3527N40–232 kodiert.

Die Gene „map3527N40–232“ und „map3527C231–361“ wurden aus dem Genom von MAP K-10 unter Verwendung von PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa Bio, Peking, China) und den Primern MAP3527N-F/R bzw. MAP3527C-F/R (Supplementary) amplifiziert Tabelle 1). Das PCR-Reaktionsverfahren zur Herstellung ist wie folgt. Vordegeneration bei 98 °C für 5 Minuten, Degeneration bei 98 °C für 10 Sekunden, Glühen bei 65 °C für 15 Sekunden, Verlängerung bei 72 °C für 10 Sekunden, mit 30 Zyklen, dann endgültige Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute. Die PCR-Produkte wurden mit einem PCR-Reinigungskit (TIANGEN, Peking, China) gereinigt. Anschließend wurden sie separat in den pET28a-Vektor (Novagen, Darmstadt, HE, Deutschland) ligiert, der durch Nde I und EcoR I doppelt verdaut worden war, unter Verwendung des Trelief SoSoo Cloning Kit (TSINGKE, Peking, China) bei 50 °C 15 Minuten. Die ligierten Produkte wurden dann in Escherichia coli (E. coli) DH5α transformiert und die Kolonien mit den richtigen Plasmiden, die pET28a-MAP3527N und pET28a-MAP3527C genannt wurden, wurden durch PCR und DNA-Sequenzierung bestimmt. Anschließend wurden die Gene „map3527N40–232“ und „map3527C231–361“ erneut unter Verwendung der Primer MAP3527NN-F/R bzw. MAP3527CC-F/R amplifiziert (Ergänzungstabelle 1) und in die pET28a-MAP3527C und pET28a-MAP3527N ligiert, die doppelt vorhanden waren. verdaut durch Hind III und Xho I unter Verwendung des Trelief SoSoo Cloning Kit. Schließlich wurden die ligierten Produkte durch PCR identifiziert und durch DNA-Sequenzierung verifiziert und erhielten die Namen pET28a-MAP3527N-MAP3527C und pET28a-MAP3527C-MAP3527N.

Die Gene ag85b (ohne 1–40 AA-Signalpeptidsequenz) und hsp70 wurden unter Verwendung des MAP K-10-Genoms als Matrize mit Ag85BNC-F/R, Ag85BCN-F/R, Hsp70NC-F/R und Hsp70CN-F amplifiziert /R-Primer und in die Konstrukte pET28a-MAP3527N-MAP3527C und pET28a-MAP3527C-MAP3527N subkloniert, die mit EcoR I und Hind III unter Verwendung des Trelief SoSoo Cloning Kit doppelt verdaut wurden. Nach der Ligation wurden die Produkte in E. coli DH5α transformiert und Transformanten, die das richtige Insert und die richtige Ausrichtung enthielten, wurden durch PCR verifiziert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die endgültigen Konstrukte, die Fusionsproteine ​​mit 66 kDa (66NC und 66CN) und 90 kDa (90NC und 90CN) kodieren, umfassen einen einzelnen ORF, der in den folgenden linearen Reihenfolgen organisiert ist: MAP3527N-Ag85B-MAP3527C, MA3527C-Ag85B-MAP3527N, MA3527N-Hsp70- MAP3527C und MA3527C-Hsp70-MAP3527N.

Das rekombinante Plasmid wurde im E. coli-Stamm BL21 (DE3) in LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin exprimiert. Eine über Nacht gewachsene Kultur von BL21, die rekombinantes Plasmid enthielt, wurde zu 1 l LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin gegeben und bei 37 °C unter Schütteln gezüchtet. Die Kulturen wurden bei einer OD600 nm von 0,6–0,8 mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) 4 Stunden lang bei 37 °C und 350 × g induziert. Die induzierten Bakterienzellen wurden geerntet und mit Puffer A (20 mM Tris-HCl – 150 mM NaCl – 10 % Glycerin – pH 8,0) beschallt und 10 Minuten bei 33.264 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden in Puffer A mit 0,5 % Natriumlauroylsarkosin gelöst und dann 24 Stunden lang gegen Puffer A mit 0,1 mM oxidiertem Glutathion und 0,9 mM reduziertem Glutathion dialysiert. Das der Dialyse unterzogene Protein wurde dann 30 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 33.264 × g zentrifugiert und der Überstand auf Ni-NAT-Harz (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Schweden) geladen. Jedes Zielprotein wurde mit Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl – 150 mM NaCl – 5 % Glycerin – 500 mM Imidazol – pH 8,0) eluiert. Jedes gereinigte Protein wurde einem ToxinEraser Endotoxin-Entfernungskit (Genscript, Nanjing, China) zur Entfernung von Endotoxin unterzogen und durch massenspektrometrische Analyse bestätigt.

Auf den Bauablauf der 74 F wurde in den vorherigen Berichten Bezug genommen21. Nachfolgend finden Sie kurze Beschreibungen. Das korrekte MAP3527C183–361-Genprodukt wurde in den pET17b-Vektor ligiert, gefolgt von der Ligation des MAP1519N1–460-Produkts in den pET17b-MAP3527C183–361. Schließlich wurde das MAP3527N33–180-Produkt in pET17b-MAP3527C183–361-MAP1519N1–460 ligiert. Das rekombinante Plasmid (pET17b-MAP3527C183–361-MAP1519N1–460-MAP3527N33–180) wurde durch Sequenzierung analysiert und in LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin in E. coli BL21 transformiert. Die Expression und Reinigung von 74 F erfolgte gemäß den oben beschriebenen Methoden. Die Bestätigung des gereinigten 74 F-Proteins wurde durch den Einsatz einer massenspektrometrischen Analyse erreicht.

Sechsunddreißig Mäuse wurden (in Dreiergruppen) mit 50 μg des 66NC-Fusionsproteins, gemischt mit Montanide ISA 61 VG (Wasser-in-Öl, Seppic, Paris, Frankreich), Montanide ISA 206 VG (Wasser-in-Öl), immunisiert -in-Wasser, Seppic) oder Montanide GEL 02 PR (wasserbasiertes Adjuvans, Seppic) Adjuvantien in einem Protein- oder PBS-Lösung:Adjuvans-Volumenverhältnis von 1:1,5. Das gleiche Volumen PBS wurde separat mit den oben genannten drei Adjuvantien als Negativkontrolle gemischt. Die sechs oben genannten Gruppen wurden über zwei Immunisierungswege geimpft. Jeder Gruppe wurde zweimal im Abstand von drei Wochen ein Gesamtvolumen von 100 μl verabreicht. Achtzehn Mäuse erhielten intramuskuläre Injektionen (IM) in den Oberschenkel und weitere achtzehn Mäuse erhielten subkutane Injektionen (SC) in den Rücken (Ergänzungstabelle 2). Fünfzehn Mäuse wurden (in Dreiergruppen) mit einem Gesamtvolumen von 100 μl mit Montanide ISA 61 VG-Adjuvans plus 50 μg 66NC-, 66CN-, 90NC- oder 90CN-Fusionsprotein oder PBS durch SC-Injektion in einer Protein- oder PBS-Lösung: Adjuvans immunisiert Volumenverhältnis von jeweils 1:1,5.

Alle Tiere in jeder Gruppe wurden drei Wochen nach der zweiten Immunisierung durch CO2-Inhalation eingeschläfert und Lymphozyten wurden aus der Milz unter Verwendung des Mouse Spleen Lymphozyten Separation Medium Kit (TBD Science, Tianjin, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers für IFN-γ ELISpot isoliert Test. Die Einzelheiten des Verfahrens sind wie folgt. Die Mäusemilz wurde aseptisch mit einer Schere abgetrennt, in kleine Stücke geschnitten und in der Homogenat-Spülflüssigkeit (TBD Science) gemahlen. Die Einzelzellsuspension wurde durch ein 70-Mesh-Sieb gewonnen und dann 10 Minuten lang bei 350 × g zentrifugiert und die Überstände wurden verworfen. Alle Gewebezellen wurden in Gewebeprobenverdünnungsmittel (TBD Science) resuspendiert und dann auf die Oberfläche des Lymphozyten-Trennmediums (TBD Science) gegeben. Die Milzlymphozyten wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 400 × g gewonnen und anschließend mit einer Waschlösung (TBD Science) gewaschen und durch Entfernen der anhaftenden Zellen gereinigt.

96 Mäuse wurden zufällig in vier Gruppen aufgeteilt und zweimal im Abstand von drei Wochen subkutan immunisiert. Gruppe I (sechs Mäuse) wurde keiner Behandlung unterzogen und diente als Blindkontrolle zur Überwachung des Körpergewichts. Gruppe II (30 Mäuse) diente als ungeimpfte Gruppe von Mäusen, denen nur das Adjuvans Montanide ISA 61 VG verabreicht wurde. Gruppe III (30 Mäuse) bestand aus Mäusen, die zweimal mit 50 μg/Maus 66NC-Fusionsprotein, gemischt mit Montanide ISA 61 VG-Adjuvans, immunisiert wurden. Gruppe IV (30 Mäuse) wurde mit 50 μg/Maus 74 F immunisiert und mit MPL-Adjuvans (Sigma Adjuvant System, Shanghai, China) in einem Protein:Adjuvans-Volumenverhältnis von 1:1 kombiniert und als Untereinheit-Impfstoffkontrolle verwendet21. Splenozyten und Serumproben von sechs Mäusen in den Gruppen II, III und IV wurden drei Wochen nach der Sekundärimmunisierung zur Analyse mittels ELISpot, ELISA und intrazellulärer Zytokinfärbung entnommen, um die Immunogenität wie nachstehend beschrieben zu bewerten.

Die verbleibenden Mäuse in jeder Gruppe (n = 24) wurden mit 109 koloniebildenden Einheiten (KBE)/Maus von MAP K-10 durch intraperitoneale Injektion herausgefordert. Sechs Mäuse pro Gruppe wurden 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der Exposition durch CO2-Inhalation eingeschläfert, und Leber und Darm wurden mit einer sterilen Schere entnommen, beobachtet und zur pathologischen Untersuchung fotografiert und in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde zur Koloniezählung verwendet, während der andere zur histopathologischen Analyse mit 10 % Formaldehyd perfundiert wurde. Darüber hinaus wurden zwei Wochen nach der Exposition Splenozyten- und Serumproben von sechs Mäusen pro Gruppe gesammelt, um intrazelluläre bzw. sekretierte Zytokine zu analysieren.

Antigenspezifische Immunantworten auf 66NC oder 74 F wurden durch IFN-γ- und IL-4-ELISpot-Assays nach Liu J et al. bewertet. mit geringfügigen Änderungen61. Einzelheiten zu den Methoden sind wie folgt. Isolierte Milzlymphozyten (5 × 105 Zellen pro Vertiefung) wurden in vorbeschichtete 96-Well-Platten mit monoklonalem Anti-IFN-γ- oder IL-4-Antikörper gegeben und 48 Stunden lang bei 37 °C mit 10 μg/ml 66NC oder 74 F-Fusion stimuliert Eiweiß. Das gleiche Volumen PBS wurde als Negativkontrolle hinzugefügt. Die Anzahl der IFN-γ- und IL-4-sekretierenden Splenozyten wurde unter Verwendung des Maus-IFN-γ- bzw. IL-4-ELISpot-Kits (Dakewe, Peking, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Platten wurden luftgetrocknet und die Flecken wurden mit einem iSpot Reader Spectrum (AID, Strassberg, Deutschland) gezählt.

Die antigenspezifischen IgG-, IgM-, IgG1- und IgG2a-Spiegel wurden mit einem herkömmlichen Sandwich-ELISA bestimmt. ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen von Costar (Corning, NY, USA) wurden über Nacht bei 4 °C mit 66NC oder 74 F (500 ng/Vertiefung) in einem Natriumhydrogencarbonatpuffer (CBS, pH 8,5) beschichtet. Um eine unspezifische Proteinbindung zu verhindern, wurde PBST (0,05 % Tween-20 in PBS, pH 7,4) 2 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % Magermilch versetzt. Nach drei Wäschen mit PBST wurden serielle Verdünnungen von Serumproben (Blut wurde aus der Schwanzvene von Mäusen entnommen und 5 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert) zu den Antigen-beschichteten ELISA-Platten gegeben, die 1 Jahr lang bei 37 °C inkubiert wurden H. Nach dem Waschen Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertes Kaninchen- oder Ziegen-Anti-Maus-IgG (ab6728)/IgM (ab97230)/IgG1 (ab97240)/IgG2a (ab97245) (1:10.000-Verdünnung in PBST, Abcam, Cambridge, MA, USA) wurden als Sekundärantikörper verwendet und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Abschließend wurden die Platten gewaschen und ein TMB-Substrat (Sigma-Aldrich, Shanghai, China) hinzugefügt und 15 Minuten lang zur Farbentwicklung inkubiert. Die Auslesung erfolgte bei OD450 nm mit einem ELx808-Mikroplattenlesegerät (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) nach Zugabe von 2 M H2SO4 als Stopplösung. Der Serumantikörpertiter ist die größte Verdünnung, bei der die OD450positiv/OD450negativ > 2,1 beträgt.

Intrazelluläre Zytokinfärbungstests (ICS) wurden zur Bewertung antigenspezifischer CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten-Reaktionen verwendet und wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt61. Kurz gesagt wurden 1,5 × 106 Splenozyten auf eine Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät und bei 37 °C mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml 66NC oder 74 F-Fusionsprotein kultiviert. Das gleiche Volumen PBS wurde als Kontrolle hinzugefügt. Nach 12-stündiger Inkubation wurden Golgi-Plug und Golgi-Stop (BD Biosciences) hinzugefügt. Die Zellen wurden 4 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden mit PE-konjugiertem Anti-Maus-CD4 (12-0041-82)/CD8α (MCD0804)-Antikörper (1:50, ThermoFisher, Waltham, MA, USA) 30 Minuten lang bei 4 °C und vor Licht geschützt gefärbt. Nach zweimaligem Waschen mit kaltem FACS-Puffer wurden die Zellen mit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) fixiert und permeabilisiert und anschließend zweimal mit Perm Wash-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden mit PE/Cy5-konjugiertem Anti-IFN-γ (1:50, , BD Biosciences), eFluor 450-konjugiertes Anti-Maus-TNF-α (1:50, MP6-XT22, 48-7321-82, ThermoFisher) bei 4 °C für 30 Minuten, vor Licht geschützt. Antikörper PE/Cy5 Ratten-IgG1 (1:50, RG1, NBP1-43076, Novus Biologicals, Littleton, Co, USA), Alexa Fluor 647 Ratten-IgG1 (1:50, KLH/G1-2-2, 0116-31, SouthernBiotech , Birmingham, AL, USA) und eFluor 450 Rat IgG1 (1:50, eBRG1, 48-4301-82, ThermoFisher) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Isotypkontrolle verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit Perm Wash-Puffer gewaschen, in PBS resuspendiert, mit einer Apogee A50-Micro Nanoscale Flow Cytometry (Apogee Flow Systems, London, UK) nachgewiesen und mit der Apogee Histogram-Software analysiert.

Serumproben wurden drei Wochen nach der sekundären Immunisierung und zwei Wochen nach der Exposition entnommen und mit nicht geimpften Mäusen verglichen. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Serumzytokine mit dem IFN-γ/TNF-α/IL-17A Mouse ELISA Kit (ThermoFisher) bestimmt. Darüber hinaus wurden mehrere Regressionsanalysen der Serum- und intrazellulären Zytokinspiegel mit CFU in Leber und Darm unter Verwendung der R-Pakete ggplot2 und ggpubr durchgeführt.

Lebern und Därme von MAP-exponierten Mäusen wurden unter aseptischen Bedingungen 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der MAP-Exposition geerntet und mit PBS gewaschen. Die Lebern und Därme wurden zur makropathologischen Analyse mit einer Digitalkamera (Canon, Tokio, Japan) fotografiert. Eine Hälfte der Leber und des Darms wurde zur Zählung der MAP-KBE verwendet. Sie wurden mit einer sterilen PBST-Lösung homogenisiert, gefolgt von Reihenverdünnungen auf 7H10-Platten mit 2 mg/L Mycobactin J und 3–4 Wochen bei 37 °C inkubiert. Und die andere Hälfte der Leber und des Darms wurde in 10 % neutralem Formalin perfusionsfixiert, dehydriert, in Paraffinblöcke eingebettet und auf säurefeste Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen (H&E) von Ziehl-Neelsen untersucht. Die Bilder wurden mit einem Nikon Eclipse E100-Mikroskop (Nikon, Tokio, Japan) erstellt. Zwei unabhängige Pathologen quantifizierten die Bewertung von Lungen- und Darmverletzungen doppelblind. Für die Bewertung der Makropathologie wurde der Prozentsatz der Granulomfläche auf der Leberoberfläche anhand der folgenden Skala von 0 bis 4 bewertet: 0 = normal (kein Granulom), 1 = leicht erhöht (<1 %), 2 = mäßig erhöht (≥ 1 %). und <3 %; 3 = stark erhöht (≥3 %), 4 = stark erhöht (>3 %) mit prominenten Granulomen. Die Anzahl der Granulome in der Darmoberfläche wurde anhand der folgenden Skala von 0 bis 3 bewertet: 0 = kein Granulom, 1 = ein Granulom, 2 = zwei Granulome und 3 = drei Granulome. Für die histopathologische Bewertung wurde der Schweregrad der Leberläsionen anhand der folgenden Skala von 0 bis 4 bewertet: 0 = normal, 1 = multiple Mikrogranulome, 2 = multiple Mikrogranulome mit fokaler Nekrose, 3 = Makrogranulome, 4 = Makro -Granulome mit massiver Nekrose. Der Schweregrad der Darmläsionen wurde anhand der folgenden Skala von 0 bis 3 bewertet: 0 = normal, 1 = multiple Mikrogranulome, 2 = Makrogranulome, 3 = Makrogranulome und entzündliche Zellinfiltration.

Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurden eine einfaktorielle und zweifaktorielle ANOVA verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 9.0.0 durchgeführt. Ein AP-Wert < 0,05 war statistisch signifikant (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle mit dieser Studie verbundenen Daten sind im Papier oder in den Zusatzinformationen enthalten. Die Ressourcen, Daten und Reagenzien der aktuellen Studie sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (2021YFD1800403) und der National Natural Science Foundation of China (32002256, 32273005) unterstützt. Die Literaturanalyse wird mit der Stork-Software (https://www.storkapp.me) durchgeführt. Die schwarze Maus wurde von Figdraw in den Figuren gezeichnet (www.figdraw.com). Wir danken LetPub (www.letpub.com) für seine sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Guanghui Dang, Siguo Liu.

Staatliches Schlüssellabor für die Kontrolle und Prävention von Tierkrankheiten, Abteilung für bakterielle Krankheiten, Harbin Veterinary Research Institute, Chinesische Akademie der Agrarwissenschaften, 678 Haping Street, Harbin, 150069, VR China

Mingzhu Shao, Ning Cui, Yangyang Tang, Fanruo Chen, Yingying Cui, Guanghui Dang und Siguo Liu

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GD und SL konzipierten und gestalteten die Studie und verfassten die Arbeit. MS führte die Experimente durch. NC, YT, FC und YC beteiligten sich an Tierimmunisierungen und Infektionen. Alle Autoren haben den Inhalt des Manuskripts geprüft und validiert.

Korrespondenz mit Guanghui Dang oder Siguo Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shao, M., Cui, N., Tang, Y. et al. Ein Impfstoffkandidat gegen Untereinheiten induziert bei Mäusen eine schützende Immunität gegen Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. npj Vaccines 8, 72 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

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Eingegangen: 07. Februar 2023

Angenommen: 10. Mai 2023

Veröffentlicht: 20. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

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